Gene POU3F4 , (DFN3) POU
DOMINIO, CLASSE 3, FATTORE DI TRASCRIZIONE 4;POU3F4
HGNC Approvato genica
Simbolo: POU3F4
Posizione
citogenetica: Xq21.1 coordinate
genomiche (GRCh38): X: 83,508,260-83,509,766 (da
NCBI)
|
Qual
è il nome ufficiale del gene POU3F4?
Il nome ufficiale di questo gene è “classe POU 3
homeobox 4.”
POU3F4 è il simbolo ufficiale del gene. Il
gene POU3F4 è conosciuto anche con altri nomi, elencati di
seguito.
Per saperne di più sui nomi geni e simboli sulla About pagina.
Descrizione
Il gene codifica per POU3F4 un fattore di trascrizione che
limita il potenziale di proliferazione e della famiglia di cellule staminali
neurali (riassunto da Choi et al., 2013). responsabile
della morfogenesi, la cui mutazione causa una rara forma con modalità di
trasmissione X-linked, DFN3. Tale sordità è di tipo misto, con una quota
trasmissiva rilevante (gap via aerea-osseo 50-60 dB). La forma di ipoacusia non
sindromica DF’N3 è caratterizzata dalla presenza di una forma mista di ipoacusia
con modalità di trasmissione legata al cromosoma X e localizzata sul cromosoma
Xq21.1. La perdita uditiva è caratterizzata sia dalla presenza di una
componente trasmissiva, risultante dalla fissazione della staffa, sia da un
progressivo deficit neurosensoriale. Talvolta una perdita uditiva
neurosensoriale profonda può mascherare la componente trasmissiva (191). A un
esame radiografico con TAC si riscontrano frequentemente una dilatazione
anormale dell’estremità laterale del meato uditivo interno oppure una
comunicazione più ampia del normale tra il canale acustico interno e l’orecchio
interno dovute a un difetto osseo o all’assenza dell’estremità laterale del
meato interno o della parete della curva basale della coclea. Come conseguenza,
c’è una comunicazione tra lo spazio subaracnoideo nel meato uditivo interno e
la perilinfa nella coclea, che comporta un’accresciuta pressione perilinfatica.
Si ritiene che questa pressione aumentata sia alla base del fenomeno di
“gusher” e porterà a una cofosi, che si osserva durante interventi sulla staffa
a cui talvolta questi pazienti sono sottoposti a causa della presentazione
clinica dell’ipoacusia che assomiglia a quella dell’otosclerosi.
Nelle donne portatrici della mutazione le manifestazioni cliniche
sono presenti in forma più lieve sia nell’aspetto malformativo che nella
perdita uditiva (53, 192).
Douville e colI. identificarono un gene nel ratto, RHS2,
omologo del gene umano POU3F4, che viene espresso durante lo sviluppo
embrionale nel cervello, nel tubo neurale e nella vescicola otica e che mappa
nel locus omologo. Perciò, sia per la sua posizione cromosomica che per la
modalità di espressione temporale e spaziale nella prima embriogenesi della coclea,
il gene POU3F4 è stato considerato un buon gene candidato per la sordità mista
legata al cromosoma X con “gusher” perilinfatico. In alcuni pazienti con questo
tipo di sordità, è stata identificata una mutazione puntiforme in questo gene e
in un individuo in cui una sordità neurosensoriale profonda mascherava
l’elemento portante di DFN3, è stata trovata una mutazione nonsense (192).
Inaspettatamente, è stato anche trovato che tre microdelezioni
su Xq21.l e una duplicazione che erano state precedentemente identificate in
pazienti con DFN3 non comprendevano il gene POU3F4. In tutti questi casi, il
riarrangiamento del DNA cromosomico era localizzato prossimalmente a POU3F4,
con una distanza fisica variabile tra 15 e 400 kb. In nessuno di questi
pazienti, né in altri due che presentavano o un “gusher” perilinfatico durante
un intervento chirurgico alla staffa o con un’anomalia all’osso temporale, sono
state trovate le mutazioni puntiformi nel gene POU3F4. De Kok e colI, hanno
concluso che questi casi possono essere causati da mutazioni che coinvolgono
sequenze di regolazione o non codificanti. In alternativa queste anomalie
potrebbero coinvolgere la struttura grossolana del cromosoma e perciò influenzare
l’espressione di POLT3F4. Una spiegazione, meno probabile, potrebbe essere che
altri geni in Xq21.i possano causare DFN3 (192). Riconoscere questa forma è
importante, perché un tentativo di oto chirurgia per ovviare al disordine
trasmissivo può facilmente portare ad una fuoriuscita massiva di endolinfa
dalla finestra ovale, ed ad una conseguente anacusia. In queste forme le
immagini delle rocche petrose GO) mostrano un’ampia dilatazione del condotto
uditivo interno, una dilatazione del labirinto cocleo-vestibolare, ed una
marcata riduzione della sepimentazione ossea cocleare fino alla scomparsa del
modiolo.
53 Phelps, P. D., Reardon, W., Pembrey, M., Bellman, S., Luxom,
L. X-linked deafness, stapes gushers and a distinctive defect of the inner
ear. Neuroradiology 33: 326-330, 1991.[PubMed: 1922747, related citations]
191 Bitner-Glindzicz, M., Turnpenny, P., Hoglund, P., Kaariainen, H.,
Sankila, E.-M., van der Maarel, S. M., de Kok, Y. J. M., Ropers, H.-H.,
Cremers, F. P. M., Pembrey, M., Malcolm, S.Further mutations in brain 4
(POU3F4) clarify the phenotype in the X-linked deafness, DFN3. Hum. Molec.
Genet. 4: 1467-1469, 1995. [PubMed: 7581392, related citations] [Full Text]
192 de Kok, Y. J. M., van der Maarel, S. M.,
Bitner-Glindzicz, M., Huber, I., Monaco, A. P., Malcolm, S., Pembrey, M. E.,
Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M. Association
between X-linked mixed deafness and mutations in the POU domain gene POU3F4. Science 267:
685-688, 1995. [PubMed: 7839145, related citations] [Full Text]
Clonazione ed espressione
De Kok et al. (1995) utilizzati primer PCR
complementari alle sequenze di geni murini per amplificare un frammento POU3F4
umana da DNA cosmide, che è stato poi utilizzato come sonda per lo screening di
una libreria cDNA del cervello fetale umano. Hanno isolato 1.4 kb di
sequenza POU3F4 cDNA umano, che conteneva la completa regione codificante la
proteina 1.083 bp. Le proteine ratti e topi sono
completamente identici, e la proteina umana contiene solo 4 sostituzioni di
amminoacidi conservative. Douville et al. (1994) hanno
dimostrato che l’omologo murino di POU3F4, chiamato Y2, è espresso durante lo
sviluppo embrionale nel cervello, il tubo neurale, e la vescicola otica a 15,5
e 17,5 giorni dopo il concepimento. 
Qual è la funzione normale del gene POU3F4?
Il gene POU3F4 fornisce istruzioni per fare
una proteina che aiuta a regolare l’attività di altri geni. Sulla base di
questo ruolo, la proteina è chiamato un fattore di trascrizione. Il
gene POU3F4 è parte di una grande famiglia di geni chiamati
geni dominio POU, tutte producono fattori di trascrizione. Geni dominio
POU giocano un ruolo nel determinare i tipi di cellule del sistema nervoso
centrale durante lo sviluppo precoce. Ogni proteina della famiglia dominio
POU ha due regioni, chiamato dominio specifico-POU e POU homeodomain, che si
legano al DNA di altri geni.
Il gene POU3F4 rischia di essere coinvolti
nello sviluppo dell’orecchio medio e interno, ed è attiva anche in alcune
regioni del cervello prima della nascita. I ricercatori non hanno
determinato quali geni sono regolati dalla proteina POU3F4.
Douville
et al. (1994) dimostrarono che il gene del mouse per
Brain-4 (POU3F4), che codifica per un fattore di trascrizione, mappe tra il
locus della proteina proteolipid Plp (300401) e
il marcatore DXMit6 vicino alla fosfoglicerato chinasi-1 locus
(PGK1; 311800). La regione cromosomica tra PGK1 e Plp è
evolutivamente conservata tra gli esseri umani e topi, che ha suggerito che il
gene POU3F4 umano si trova nell’intervallo Xq13-q22. Douville
et al. (1994)hanno suggerito che sia la sua
posizione mappata e il suo temporale / spaziale pattern di espressione in
embriogenesi presto reso POU3F4 un gene candidato per il locus DFN3
(DFNX2; 304.400). Per confermare e perfezionare la localizzazione del
gene umano, de Kok et al . (1995) amplificato
un frammento di gene POU3F4 genomica murina mediante PCR e ibridati a Southern
blots contenenti DNA EcoRI digerito da pazienti con delezioni Xq21.Ibridazione
è stato visto nel controllo maschile ma non nei pazienti DFN3 che portavano le
eliminazioni di dimensione variabile in Xq21. Con l’ibridare le sonde a
cosmidi da un contig che attraversava il locus DFN3, hanno localizzato il gene
POU3F4 20 kb distale DXS995.
Genetica
molecolare
In
4 su 6 pazienti con X-linked sordità mista (vedi DFNX2, 304.400), de Kok
et al. (1995)dimostrarono una mutazione
puntiforme; in un quinto dei pazienti, nei quali sordità profonda
neurosensoriale mascherato l’elemento conduttore di DFN3, una mutazione
nonsense è stata
trovata (300.039,0001 – 300039,0,005 mila). Inaspettatamente, de Kok
et al. (1995) trovarono che 3 Xq21
microdelezioni e 1 duplicazione che erano state identificate in precedenza in
pazienti con DFN3 non comprendono il gene POU3F4. In tutti i 4 istanze, il
riassetto si trovava prossimale e 5-prime al POU3F4, con distanze fisiche che
variano tra 15 e 400 kb. In nessuno di questi pazienti, né altri 2 sia con
un pozzo petrolifero perilinfatici durante chirurgia della staffa o un difetto
osseo temporale, sono stati rilevati mutazioni puntiformi nel gene
POU3F4. De Kok et al. (1995) conclusero
che questi casi possono essere causati da mutazioni che colpiscono non
codificante 5-prime o sequenze regolatrici. In alternativa, queste
aberrazioni possono influenzare la struttura cromosomica lordo e quindi
influenzare l’espressione di POU3F4. A meno probabile spiegazione potrebbe
essere la presenza di altri geni in Xq21.1 che può causare DFN3. Bitner-Glindzicz
et al. (1995) descrissero mutazioni
specifiche nel gene POU3F4 in 2 famiglie con sordità legata al cromosoma X e ha
suggerito che l’esperienza chiarisce ulteriormente il fenotipo di
DFN3. Essi hanno concluso che DFN3 è caratterizzata non da sordità
conduttiva e neurosensoriale misti associati al pozzo petrolifero perilinfatico
a chirurgia della staffa, ma da una profonda sordità neurosensoriale, con o
senza un componente conduttivo associato ad una anomalia di sviluppo unico
dell’orecchio. La loro famiglia 1 consisteva di una madre e 2 figli di
origine finlandese. Il probando avevano perdita di udito mista di 40-50 dB
e suo fratello una perdita di 75-95 dB. Il primo fratello è stato trovato
per avere un pozzo petrolifero perilinfatica al momento della stapedectomia. Sequenziamento
del prodotto di PCR / SSCP rivelato una delezione di 4 bp nelle basi 862-866
del loro clone, situato nel homeodomain del gene
POU3F4 (600420,0006). Famiglia 2 era una famiglia britannica di 3
maschi affetti. Tutti i maschi affetti avevano profonde sordità
neurosensoriale diagnosticata durante l’infanzia, senza suggerimento di un
componente conduttivo. Anche se 2 erano di intelligenza normale, 1 aveva
un moderatamente grave difficoltà di apprendimento di causa
sconosciuta. Su TAC alta risoluzione della coclea eseguito in 1 dei
maschi, è stata trovata la carenza caratteristica osso tra il giro basale della
coclea ed il meato uditivo interno. In studi di 4 generazioni di una
famiglia, l’origine della mutazione in una nonna eterozigote potrebbe essere
identificato, la mutazione essendo una transizione C-T al nucleotide 935
risultante in un alanina a valina sostituzione in un residuo altamente
conservato della homeodomain della proteina
predetto (600420,0007). Da osservazioni DFN3 in associazione con un
complesso di duplicazione / inversione paracentric, de Kok
et al. (1995)hanno concluso che esiste un elemento
regolatorio situato almeno 400 kb a monte del gene POU3F4 e che questo è stato
scollegato dal gene POU3F4 dall’inversione. Il lavoro di de Kok
et al. (1995) e di Bitner-Glindzicz
et al. (1995) ha indicato che sia sordità
neurosensoriale misto e puro può essere causata da mutazioni nel gene POU3F4 e
che condividono la stessa fenotipo radiologica come descritto da Phelps
et al. (1991). Friedman et al. (1997) trovarono
una nuova mutazione nel gene POU3F4 in 2 su 5 pazienti con collegata a X
sordità mista studiati. Anche se le storie cliniche e anomalie
radiografiche erano caratteristiche negli altri 3 pazienti, no mutazione è
stata identificata. In 3 pazienti non imparentati con deiscenza del canale
semicircolare e senza storia familiare della malattia o della sordità, Crovetto
et al. (2012)mutazioni esclusi nel esone
codificante del gene POU3F4. In 6 famiglie coreane con sordità legata al
cromosoma X, Choi et al. (2013) ha
individuato 6 mutazioni patogene POU3F4, di cui 5 nuove mutazioni (vedi, ad
esempio, {} e 300.039,00010 300039,0011). C’erano 2 mutazioni
missenso, 2 troncante mutazioni, e 2 mutazioni che causano l’estensione della
proteina nella regione 3-prime untranslated al di fuori dei domini POU e
NLS. Tutte le mutazioni producevano in attività trascrizionale diminuito
di POU3F4 in studi di espressione cellulari. Le mutazioni di estensione
sono stati localizzati nel citoplasma e sottoposti degradazione del proteasoma
a causa di alterazioni strutturali. Una delle mutazioni frameshift portato
a bassi livelli di proteine che potrebbero essere ripristinati da
un inibitore del proteasoma, anche se l’attività trascrizionale Impossibile
ripristinare a livelli biologicamente significativi.
Modello animale
DFN3
(DFNX2, 304.400), una non sindromica sordità mista cromosoma X-linked, è
causata da mutazioni nel gene BRN4, che codifica per un fattore di trascrizione
POU. Minowa et al. (1999)ha creato topi
Brn4-deficienti. Avevano sordità profonda. Nessuna modifica lordi
morfologiche sono stati osservati in ossicini conduttivi o coclea, anche se
c’era una drastica riduzione del potenziale endocochlear. La microscopia
elettronica ha rivelato gravi alterazioni ultrastrutturali cocleari fibrociti
legamento spirale. Questi risultati hanno suggerito che queste fibrociti,
che sono mesenchimali di origine e per i quali un ruolo nella ione potassio
omeostasi ‘stato ipotizzato, possono svolgere un ruolo critico nella funzione
uditiva. Il fenotipo del topo mutante’ legato al sesso agitarsi ‘(SLF) è
causata da malformazioni dello sviluppo dell’orecchio interno che si traduce in
perdita e disfunzione vestibolare udito. Esperimenti di mappatura pilota
hanno suggerito che il gene del mouse Brn4 (omologo umano, POU3F4) cosegregate
con il locus SLF sul mouse cromosoma X.. Phippard
et al. (2000) identificarono la natura della
mutazione SLF: una inversione cromosomica X con 1 breakpoint vicino a
Brn4. Questa inversione elimina selettivamente espressione del gene Brn4
nell’orecchio interno sviluppo, ma non nel tubo neurale. Phippard
et al. (2000) suggeriva che la mutazione SLF
è un buon modello di topo per la forma più diffusa di X-linked sordità
congenita nell’uomo, che è associata a mutazioni del ortologo Brn4 umano,
POU3F4.
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VARIANTI ALLELICHE (11 Esempi selezionati): |
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.0001 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, LEU298TER [dbSNP: rs267606974] [ClinVar] |
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In un paziente con collegata a X sordità mista |
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.0002 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, ASP215TER [dbSNP: rs267606975] [ClinVar] |
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In paziente 3105 con X-linked sordità mista |
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0,0003 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, LYS202TER [dbSNP: rs104894920] [ClinVar] |
|
In una famiglia studiato in precedenza da Reardon |
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0,0004 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, LEU317TRP [dbSNP: rs104894921] [ClinVar] |
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In paziente 5736 con X-linked sordità mista |
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.0005 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, LYS334GLU [dbSNP: rs104894922] [ClinVar] |
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In una famiglia con collegata a X sordità mista |
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0,0006 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, 4-BP DEL [dbSNP: rs730882189] [ClinVar] |
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In 2 fratelli con perdita dell’udito e misto |
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0,0007 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, 935c-T, ALA-VAL [dbSNP: rs387906502] [ClinVar] |
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In una famiglia britannica in cui 2 fratelli e il |
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0,0008 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, ARG330SER [dbSNP: rs104894923] [ClinVar] |
|
In un paziente con collegata a X sordità mista |
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0,0009 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, ARG323GLY [dbSNP: rs104894924] [ClinVar] |
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In un paziente con collegata a X sordità mista |
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0,0010 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, 1-BP DEL, 1069A [dbSNP: rs398122517] [ClinVar] |
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In 2 fratelli affetti di una famiglia coreana |
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0,0011 SORDITA ‘, X-linked 2 |
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POU3F4, 1-BP DUP, 950T [dbSNP: rs398122516] [ClinVar] |
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In una probando coreano e lo zio materno con |
Fa
le POU3F4 gene caratteristiche condividere con gli altri geni?
Il gene POU3F4 appartiene ad una famiglia di
geni chiamati homeobox (homeoboxes).
Una famiglia genica è un gruppo di geni che condividono
caratteristiche importanti. Classificare singoli geni in famiglie aiuta i
ricercatori descrivono come i geni sono legati gli uni agli altri. Per
ulteriori informazioni, vedere Quali sono famiglie di geni? Nel
manuale.
Come sono i cambiamenti nel gene POU3F4 relativi
alle condizioni di salute?
Sordità sindromica – causata da
mutazioni nel gene POU3F4
Le mutazioni dentro o vicino alla causa gene POU3F4 una
forma di sordità non sindromica (perdita di udito senza segni e sintomi
correlati che interessano altre parti del corpo) chiamato DFN3. Questa
forma di perdita di udito di solito comporta anomalie sia l’orecchio interno e
medio (perdita uditiva mista). Le persone che hanno chirurgia per questa
forma di sordità sono ad alto rischio di una complicazione chiamata pozzo
petrolifero perilinfatica. Questa complicazione provoca una perdita di
fluido dall’orecchio interno che può provocare gravi vertigini e una perdita
totale dell’udito.
Sono state identificate più di 15 mutazioni POU3F4. La
maggior parte di questi cambiamenti genetici alterare blocchi singoli proteine
(aminoacidi) nella proteina POU3F4 o eliminare una piccola
quantità di materiale genetico del gene.Le mutazioni impediscono alle cellule
di produrre qualsiasi proteina POU3F4 o alterare regioni della proteina che
sono fondamentali per il legame al DNA. La mancanza di proteine
POU3F4 funzionale sconvolge probabilmente il normale sviluppo
delle strutture dell’orecchio medio e interno, con conseguente perdita
dell’udito.
In alcuni casi di DFN3, mutazioni sono stati trovati in una
sezione del DNA vicino al genePOU3F4. I ricercatori ritengono che
questa regione possa avere un ruolo nella regolazione del gene POU3F4.
Citogenetica Località: Xq21.1
Posizione molecolare sul cromosoma X: coppie di basi
83.508.261 a 83.509.767
(Homo sapiens Annotazione di
uscita 107, GRCh38.p2) (NCBI 
)
Il gene POU3F4 si trova sul lungo (q)
braccio del cromosoma X nella posizione 21.1.
Più precisamente, il gene POU3F4 si trova
dalla coppia di basi 83.508.261 a 83.509.767 coppia di basi sul cromosoma X.
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REFERENCES |
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OTOF -related
Sordità
Sinonimi: DFNB9, DFNB9 non sindromica perdita dell’udito
Un Eliot Shearer, MD, PhD e Richard JH Smith,
MD.
Distacco
iniziale: 29 feb, 2008; Ultimo aggiornamento: 30 LUGLIO 2015.
Sommario
Caratteristiche cliniche.
OTOF -related
sordità (DFNB9 perdita di udito non sindromica) è caratterizzata da due
fenotipi: prelinguale perdita di udito non sindromica e, meno frequentemente,
sensibile alla temperatura non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN). La
perdita di udito non sindromica è bilaterale grave a profondacongenita sordità. Nei primi uno
o due anni di vita, OTOF -related la sordità può sembrare di
essere una neuropatia uditiva basata su test elettrofisiologico in cui uditivi
risposte del tronco cerebrale (ABR) sono assenti e le emissioni otoacustiche
(OAEs) sono presenti. Tuttavia, con il tempo OAE scompaiono e test
elettrofisiologico è più coerente con un difetto cocleare. La distinzione
tra neuropatia uditiva e un difetto cocleare è importante come impianti
cocleari possono essere di valore marginale in persone con neuropatia uditiva
ma hanno dimostrato di essere efficace per gli individui con OTOF -related
sordità. TS-NSAN è caratterizzata da perdita normale-a-mite audizione in
assenza di febbre e significativa perdita di udito che vanno da grave a
profonda in presenza di febbre. Quando la febbre si risolve, sentendo
ritorna normale.
Diagnosi / testing.
La
diagnosi di sordità OTOF -related si sospetta sulla base di
dati clinici, inclusi i risultati delle ABR e OAE. La diagnosi è
confermata dalla identificazione di varianti sordità legati biallelic in OTOF, ilgene che codifica per la proteina
otoferlin.
Gestione.
Trattamento
delle manifestazioni: in soggetti con nonsyndromic bilaterale congenita perdita di udito, apparecchi
acustici nel più breve tempo possibile, la considerazione di impianti cocleari,
che hanno dimostrato di essere efficace per OTOF -related
sordità, e programma educativo per le persone con deficit uditivo.
Prevenzione
delle manifestazioni primarie: Per gli individui con TS-NSAN,
prevenire febbri e le altre condizioni di attività / ambientali che potrebbero
causare la temperatura corporea a salire.
Sorveglianza: Negli
individui con nonsyndromic bilaterale congenita perdita di udito, l’esame
semestrale / annuale da un medico familiare con deficit uditivo ereditario,
ripetere audiometria inizialmente ogni tre-sei mesi per determinare se la perdita
dell’udito è progressiva.
La
valutazione dei parenti a rischio: la valutazione di fratelli e
sorelle il più presto possibile dopo la nascita per la perdita
dell’udito; se le varianti sordità legati OTOF della
famiglia sono noti, test di genetica molecolare di
fratelli e sorelle subito dopo la nascita in modo che un adeguato supporto e la
gestione precoce possono essere forniti per il bambino e la famiglia.
Consulenza genetica.
OTOF sordità
-related è ereditata come autosomica recessiva maniera. Al
momento del concepimento, ogni sib di un individuo con OTOF -related
sordità ha una probabilità del 25% di avere OTOFsordità -related,
una probabilità del 50% di essere un corriere, e una probabilità del 25% di
non avere una variante sordità legata in OTOF. Test Carrier
per i parenti e test prenatale per gravidanze sono possibili se sono note le
varianti sordità legati in una famiglia.
GeneReview Scope
|
OTOF -related Sordità: Incluso Fenotipi 1 |
|
Per i sinonimi e nomi obsoleti vedere nomenclatura.
1.
Per le altre cause genetiche di questi fenotipi,
vedere Diagnosi differenziale.
Diagnosi
Risultati
Suggestive
OTOF -related
sordità deve essere sospettata in individui con:
- Congenita neuropatia uditiva
senza una storia di fattori ambientali causali (ad esempio,
iperbilirubinemia neonatale e ipossia neonatale); - Sensibile alla temperatura
non sindromica neuropatia uditiva.
Nota:
Durante i primi uno o due anni di vita, OTOF -related la
sordità può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test
elettrofisiologico in cui uditivi risposte del tronco cerebrale (ABR) sono
assenti e le emissioni otoacustiche (OAEs) sono presenti. Tuttavia, con il
tempo OAE scompaiono e test elettrofisiologico diventa più coerente con un
difetto cocleare.
Stabilire
la diagnosi
La
diagnosi di OTOF -related sordità è stabilito in un probando con l’identificazione di
varianti sordità legati biallelic in OTOF su test di genetica molecolare (vedi tabella 1).
Metodi
di analisi molecolari possono includere singolo gene sperimentazione, l’uso di un
pannello multi-gene,e test genomico.
- Singolo gene test. Analisi
della sequenza di OTOF viene eseguita prima seguita da
gene targeting analisi delezione / duplicazione se
viene rilevato un unico o no variante di sordità legate. - Un multi-gene pannello che include OTOF e
altri geni di interesse (vedi Diagnosi differenziale) può
essere presa in considerazione se il test singolo-gene è negativa o come
test di prima linea, se il test singolo-gene non è disponibile per OTOF. Nota:
I geni inclusi e sensibilità di pannelli
multi-gene variano da laboratorio e nel tempo. - Test genomico può
essere presa in considerazione se singola seriale gene testing (e / o l’uso di un
pannello multi-gene) non hanno confermato la diagnosi in un individuo con
caratteristiche di OTOF -related sordità. I test
possono includere tutto il sequenziamento dell’esoma (WES), all’in-
grosso del genoma sequenziamento (WGS),
e il sequenziamento dell’intero mitocondriale (WMitoSeq).Per problemi da considerare nella interpretazione dei risultati dei test
genomici, clicca qui.
Tabella
1.
Ricerca di genetica molecolare Utilizzato in OTOF -related
Sordità
|
Gene1 |
Metodo di prova |
Percentuale di probandi con Sordità-correlate varianti 2rilevabili |
|
OTOF |
Le analisi della sequenza 3 |
99% |
|
Gene targeting delezione / duplicazione analisi 4 |
Sconosciuto 5 |
1.
Vedi Tabella Geni A. e database per cromosoma locus e proteine.
2.
Vedere Genetica Molecolare per informazioni
sulle varianti alleliche rilevati in questo gene.
3.
Le analisi della sequenza rileva le varianti che sono
benigni, probabilmente benigno, di significato incerto, probabilmente la
sordità legata, o sordità correlati. Varianti sordità correlati possono
includere piccole intragenica delezioni / inserzioni e missense, nonsense, e
varianti sito di splicing; tipicamente, esone o all’in- grosso gene delezioni / duplicazioni non
vengono rilevati. Per problemi da considerare nell’interpretazione
di analisi di sequenza risultati, fare
clic qui.
4.
Gene targeting analisi delezione / duplicazione rileva
delezioni o duplicazioni intragenica e può essere eseguito come un singolo
o multi-gene pannello. I metodi che
possono essere utilizzati possono includere: PCR quantitativa, a lungo raggio PCR,
multiplex ligation-dipendente probe amplificazione (MLPA), o un
microarray gene targeting progettato per rilevare mono esone delezioni o duplicazioni.
5.
C’è stata una segnalazione di una delezione che coinvolge OTOF [Zadro
et al 2010], ma un recente studio di valutazione CNVs in 686
soggetti con perdita di udito non mostravano copia numero varianti in OTOF [Shearer
et al 2014] e di conseguenza il tasso di rilevamento è
sconosciuto.
Geneticamente
Correlate (alleliche) Disturbi
Nessun fenotipi
diversi da quelli discussi in questo GeneReview sono noti per
essere associati con varianti sordità correlati al OTOF.
Caratteristiche cliniche
Descrizione
clinica
I due
fenotipi osservati nei OTOF -related sordità sono prelinguale
perdita di udito non sindromica e, meno frequentemente, sensibile alla
temperatura non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN).
OTOF -related
perdita di udito non sindromica è caratterizzata da prelinguale, la sordità di
solito grave a profonda senza anomalie dell’orecchio interno alla RM o TAC
esame delle ossa temporali. Grave la sordità è definita come la perdita di
71-90 dB dell’udito; sordità profonda è una perdita uditiva superiore a 90
dB.
TS-NSAN
presenta tipicamente con normale da lieve perdita dell’udito quando l’individuo
è afebrile. Con comparsa di febbre, le persone con TS-NSAN hanno una
significativa perdita di udito che vanno da grave a profonda; udito torna
alla normalità una volta che la febbre è stato risolto. Discriminazione
discorso è stato descritto come normale è leggermente diminuito al basale con
significativo peggioramento durante i periodi febbrili.
Genotipo-fenotipo
Correlazioni
Solo
limitato genotipo – fenotipo correlazioni sono state
fatte, che coinvolge soprattutto i rapporti di sensibile alla temperatura non
sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN).
- Una variante troncando
patogena, c.4467dupC (p.Ile1490HisfsTer19), ha causato una grave perdita
di udito da profondi mentre un cambiamento missenso omozigote, c.4718T>
C (p.Ile1573Thr), ha causato una perdita di udito moderata che era
progressista [Yildirim -Baylan et al 2014]. - Un missense allele, c.1544T> C (p.Ile515Thr), è
stato trovato nel eterozigoti state in un individuo che è stato osservato
per avere TS-NSAN [Varga et al 2006]. - Una delezione, c.5410_5412delGAG
(p.Glu1804del), è stato segnalato per essere omozigote in
tre membri di una famiglia con simili TS-NSAN [Marlin
et al 2010]. - Un individuo è stato trovato
ad avere c.2975_2976delAG
(p.Gln994ValfsTer7) e c.4819C> T (p.Arg1607Trp) varianti
sordità legate a OTOF su workup per TS-NSAN [Wang
et al 2006].
Nomenclatura
Perdita
di udito non sindromica causata da mutazioni di OTOF rischia
di essere classificato come neuropatia uditiva quando prima rilevata nei
neonati nel sentire le prove a causa di assenza di risposte uditive del tronco
encefalico (ABR) e la presenza di otoemissioni acustiche (OAEs). Tuttavia,
questa mancata corrispondenza scompare nel corso del tempo in modo tale che la
sordità a causa di OTOF assomiglia ad un tipico sordità
genetica cocleare da diversi anni di età. Dissincronia uditiva è un
termine storico usato per descrivere la mancata corrispondenza tra l’attività esterna
e interna delle cellule dei capelli riflessa dalla differenza tra ABR e test
OAE e neuropatia uditiva o uditiva disturbo dello spettro la neuropatia è
preferito.
Prevalenza
La
prevalenza mondiale di varianti sordità legata OTOF nelle
persone con grave a profonda congenitaautosomica recessiva sordità
sindromica rimane sconosciuto.
- Gli studi in popolazioni
spagnole suggeriscono che OTOF può essere responsabile di
5% -8% dei prelinguale autosomica recessiva perdita di
udito [Rodríguez-Ballesteros et al 2008]. - Uno studio della popolazione
pakistana suggeriscono che la frequenza delle varianti sordità relativo è
di circa il 2,3% nelle persone con recessiva congenita / prelinguale
insorgenza grave da sordità profonda[Choi
et al 2009].
Diagnosi differenziale
Congenita
(o prelinguale) ereditato ipoacusia colpisce circa uno su 1.000
neonati; Il 30% di questi bambini hanno anomalie aggiuntive, rendendo la
diagnosi di una forma sindromica di ipoacusia possibile (vedereereditaria Sordità e dell’udito Panoramica perdita). Nei
paesi sviluppati, circa la metà dei restanti figli (cioè, il 70% con
compromissione di udito non sindromica) segregate varianti sordità legate
a GJB2 [Smith et al 2005].Varianti in 28 geni (tra
cui OTOF) sono stati implicati in congenita autosomica recessiva sordità non
sindromica
Altre
neuropatie ereditarie uditive non sindromiche sono i seguenti:
- DFNB59, autosomica recessiva neuropatia
uditiva causata da varianti DFNB59, il gene che codifica per la proteina
pejvakin [Delmaghani et al 2006, Schwander
et al 2007] - Autosomica dominante neuropatia uditiva
causata da varianti in DIAPH3, il gene della proteina di codifica
omologo diafana 3
Varianti
sordità legata OTOF sono estremamente improbabile in un
bambino con grave a profonda perdita dell’udito in un solo orecchio e le
risposte elettrofisiologiche coerenti con neuropatia uditiva. Invece, un
difetto cocleare dovrebbe essere considerata; La RM è indicata [Buchman
et al 2006].
Gestione
Le
valutazioni dopo la diagnosi iniziale
Per
stabilire la misura del coinvolgimento in un individuo con diagnosi di OTOF -related
sordità, le seguenti valutazioni sono raccomandati (vedi ereditaria Sordità e dell’udito Panoramica Loss):
- La valutazione di acuità
uditiva (prove di emissione ABR, toni puri audiometria) - Si consideri la consultazione
con un genetista medico e / o un consulente genetico
Trattamento
delle manifestazioni
Vedere ereditaria sordità e perdita dell’udito Panoramica per
i dettagli.
Audizione
abilitazione per quelli con non sindromica bilaterale congenita perdita di udito
- Gli apparecchi acustici
devono essere montati il più presto possibile. - L’impianto cocleare (CI)
dovrebbe essere considerato il più presto possibile. Case report
hanno mostrato buoni risultati di CI in individui con OTOF -related
sordità [Rouillon et al 2006, Wu
et al 2011] e rivisto in Eppsteiner
et al [2012].
Nota: Durante i primi uno o due anni di vita, OTOF -related
la sordità può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test
elettrofisiologico; tuttavia, con il tempo di test elettrofisiologico
diventa più consistente con un difetto cocleare. Distinguere tra una
neuropatia uditiva e un difetto cocleare è importante in quanto gli
impianti cocleari possono essere di valore marginale in persone con
neuropatia uditiva, come quello osservato in neuronopathy sordità-distonia ottica (DDON) [Brookes
et al 2008] così come gli individui con sordità causata da
varianti patogeniche nei geni-gangliari espresso spirale[Eppsteiner
et al 2012].
I
programmi educativi progettati per le persone con danni all’udito sono
appropriati.
Prevenzione
delle manifestazioni primarie
Per gli
individui con TS-NSAN:
- Prevenire episodi febbrili.
- Evitare il livello di
esercizio e / o condizioni ambientali che causerebbe temperatura corporea
a salire. - Trattare episodi febbrili più
rapidamente possibile tornare temperatura corporea normale. - Educare gli individui e dei
loro assistenti che l’insorgenza di perdita dell’udito può essere il primo
segno di un evento che richiede un trattamento antipiretico /
infettiva [Starr et al 1998]. Occorre
incoraggiare le opportune precauzioni, tra cui evitare situazioni
potenzialmente pericolose o rumorosi.
Sorveglianza
Per gli
individui con nonsyndromic bilaterale congenita perdita di udito:
- Esaminare semestralmente o
annualmente da un medico familiare con deficit uditivo ereditario. - Ripetere audiometria
inizialmente ogni tre-sei mesi per determinare se la perdita dell’udito è
progressiva.
Agenti
/ Circostanze da evitare
Gli
individui con TS-NSAN. Evitare le temperature eccessive del corpo,
quando possibile. Studi di follow-up non hanno dimostrato il successo
delle misure preventive come un trattamento efficace a lungo termine.
Valutazione
del Parenti a rischio
È
opportuno chiarire lo status genetico di fratelli e sorelle, apparentemente
asintomatici di un probando subito dopo la nascita
da test genetici molecolari delle
varianti sordità legati OTOF presenti nei probandi in modo che
un adeguato supporto e la gestione precoce possono essere forniti per il
bambino e la famiglia.
Vedere consulenza genetica per le questioni
legate alla sperimentazione di a rischio parenti per consulenza genetica scopi.
Terapie
Sotto inchiesta
Ricerca ClinicalTrials.gov per l’accesso alle
informazioni sugli studi clinici per un’ampia gamma di condizioni.Nota: Non ci
possono essere gli studi clinici per questa condizione.
Consulenza genetica
La
consulenza genetica è il processo di fornitura di individui e famiglie con
informazioni sulla natura, l’ereditarietà, e le implicazioni di malattie
genetiche per aiutarli a prendere decisioni personali e mediche informate. I
seguenti sezione tratta la valutazione del rischio genetico e l’uso della
storia familiare e test genetici per chiarire lo status genetico per i
familiari. Questa sezione non è destinata a affrontare tutte le
questioni personali, culturali, etiche o che gli individui possono affrontare o
per sostituire la consultazione con una genetica professionale. -ED.
Modalità
di eredità
OTOF sordità
-related è ereditata come autosomica recessiva maniera.
Rischio
per i familiari
I
genitori di un probando
- I genitori di un bambino
con OTOF -related sordità sono eterozigoti obbligati
(cioè, portatori di una variante OTOF sordità correlati). - Eterozigoti (vettori) sono
asintomatici.
Fratelli
e sorelle di un probando
- Al momento del concepimento,
ogni sib di un individuo con OTOF -related sordità ha una
probabilità del 25% di essere sordo, una probabilità del 50% di essere
un corriere, e una probabilità del
25% di non avere una variante sordità legata in OTOF. - Eterozigoti (vettori) sono
asintomatici.
Prole
di un probando. I figli di un individuo
con OTOF -related sordità sono eterozigoti obbligati
(portatori di una variante la sordità legata in OTOF).
Altri
membri della famiglia di un probando. Per ogni sib dei
genitori del probando, la probabilità di essere un vettore di un OTOF variante
sordità relativo è del 50%.
Carrier
(eterozigoti) Rilevamento
Test
Carrier per i parenti richiede la previa individuazione delle varianti sordità
legati OTOF della famiglia.
Genetica
Related Issues Counseling
Vedere
Gestione, Valutazione di parenti a rischio per
le informazioni sul test parenti a fini di diagnosi precoce e trattamento.
Pianificazione
famigliare
- Il momento ottimale per la
determinazione dello status di genetica e discussione della disponibilità
di test prenatale è prima della gravidanza. - È opportuno offrire una consulenza genetica (compresa
la discussione della probabilità che i figli sarà opzioni sordi e
riproduttivi) di giovani adulti che hanno OTOF -related
sordità, sono portatori, o possono essere portatori.
I
seguenti punti sono degni di nota:
- La comunicazione con le
persone che sono sordi richiede i servizi di un interprete qualificato. - Le persone sorde possono
visualizzare la sordità come una caratteristica distintiva e non come un
handicap, perdita di valore, o patologie che richiedono una
“cura” o “cura”, o da “impedito”. In
effetti, avendo un bambino con la sordità può essere preferito avere un
figlio con udito normale. - Molte persone sorde sono
interessati ad ottenere informazioni sulla causa della loro sordità,
comprese le informazioni sui servizi sanitari, educativi e sociali,
piuttosto che informazioni circa la prevenzione, la riproduzione o la
pianificazione familiare. Come in tutta la consulenza genetica, è
importante per il consulente di individuare, riconoscere e rispettare /
della famiglia dell’individuo domande, dubbi e paure. - L’uso di alcuni termini è
preferito: probabilità o possibilità vs rischio; non udenti e di
udito vs udenti.Termini come “affetto”, “anormale”
e “che causano malattie” dovrebbero essere evitati.
Banking DNA è la conservazione di
DNA (tipicamente estratto da globuli bianchi) per un possibile uso
futuro.Poiché è probabile che la metodologia di prova e la nostra comprensione
dei geni, varianti alleliche, e sordità miglioreranno in futuro, occorre tenere
in considerazione per bancaria DNA di affetti individui.
Test
prenatale
Se le
varianti sordità legati OTOF sono stati identificati in
un colpiti membro della famiglia, test
prenatale può essere disponibile da un laboratorio clinico che offre sia la
sperimentazione di questo gene o test prenatale personalizzato.
Le
richieste di test prenatale per le condizioni che (come OTOF -related
sordità) non influenzano l’intelletto o durata della vita non sono
comuni. Possono esistere differenze di prospettiva tra i professionisti
medici e all’interno delle famiglie per quanto riguarda l’uso di test
prenatali, in particolare se il test viene presa in considerazione ai fini
della interruzione della gravidanza, piuttosto che la diagnosi
precoce. Anche se le decisioni riguardanti test prenatale sono la scelta
dei genitori, la discussione di questi problemi è appropriato.
Diagnosi
genetica preimpianto (PGD) può essere un’opzione per alcune famiglie
in cui sono state individuate le varianti sordità legati OTOF.
Risorse
Personale
GeneReviews ha selezionato le seguenti organizzazioni malattia-specifici e / o
di supporto ombrello e / o registri per il beneficio di soggetti con questo
disturbo e le loro famiglie. GeneReviews non è responsabile per le
informazioni fornite da altre organizzazioni. Per informazioni sui
criteri di selezione, clicca qui.
- Alexander Graham Bell Associazione
per sordi e udenti
3417
Volta Luogo Northwest
Washington
DC 20007
Telefono: 866-337-5220
(numero verde); 202-337-5220; 202-337-5221 (TTY)
Fax: 202-337-8314
Email: info@agbell.org
Ascolto e Lingua parlata Knowledge Center
- American Society for
bambini sordi (ASDC)
800
Florida Avenue Northeast
Suite
2047
Washington
DC 20002-3695
Telefono: 800-942-2732
(numero verde Parent Hotline); 866-895-4206 (voce verde / TTY)
Fax: 410-795-0965
E-mail: info@deafchildren.org; asdc@deafchildren.org
- udito del mio bambino
Il
sito, sviluppato con il sostegno del National Institute on Deafness e altri
disturbi della comunicazione, fornisce informazioni su screening uditivo
neonatale e perdita dell’udito.
- Associazione Nazionale dei
Sordi (NAD)
8630 Fenton Street
Suite 820
Silver Spring MD 20910
Telefono: 301-587-1788; 301-587-1789
(TTY)
Fax: 301-587-1791
Email: nad.info@nad.org
- National
Library of Medicine Genetics Home Reference
- Geni NCBI e malattia
Genetica molecolare
Le
informazioni contenute in tabelle Genetica Molecolare e OMIM può differire da
quello in altre parti del GeneReview: tavoli può contenere informazioni più
recenti. – ED.
Tabella
A.
OTOF-Related Sordità: Geni e database
|
Locus Nome |
Gene |
Cromosoma Locus |
Proteina |
Locus specifico |
HGMD |
|
DFNB9 |
Sordità Gene Mutation Database (OTOF) |
I dati sono compilati dai seguenti riferimenti standard:
gene da HGNC; cromosoma locus, nome luogo,
regione critica, complementazione gruppo da OMIM; proteine da UniProt. Per una descrizione di
database (Locus specifico, HGMD) a cui vengono forniti i link, clicca qui.
Tabella
B.
OMIM Voci per OTOF-Related Sordità (Vedi tutti in OMIM)
|
SORDITA ‘, |
|
|
OTOFERLIN; OTOF |
Genetica
molecolare Patogenesi
Otoferlin
appartiene ad una piccola famiglia di proteine citosoliche
membrana ancorata che include dysferlin (codificata dal DYSF), myoferlin
(codificata dal MYOF), e un quarto membro predetto fer-1-like
proteine 4 (codificata dal FER1L4). I geni
Ferlin sono così chiamati a causa della loro somiglianza strutturale a un genetrovato in C. elegans, fer-1,
che è richiesto per il normale maturazione degli spermatozoi.
Con
l’eccezione di OTOF, perdita dell’udito non è stata associata
con i membri di questo gene famiglia DYSF è
associata con tre diversi tipi di miopatie distali:. Miyoshi miopatia (MM),
arti muscolare dei cingoli di tipo distrofia 2B (LGMD2B), e miopatia distale
con insorgenza anteriore tibiale (DMAT) [Bashir
et al 1998, Liu ed altri 1998, Weiler
ed altri 1999] (vedi Dysferlinopathy). Myoferlin, che è
codificata dal MYOF, è necessaria per il normale fusione dei
mioblasti [Doherty et al 2005]. La funzione di
fer-1-4 come le proteine non è nota (figura 1).
![Figura 1. . Proteine organizzazione motivo per il gene famiglia Ferlin umana come determinato da SMART [Schultz et al 1998 Letunic et al 2002] C2 (verde) è il motivo legante il calcio.](http://www.otorino-tanzariello.it/images/articoli/Sordita_nonsindromiche/genepou/image006.gif)
Proteine organizzazione
motivo per il gene famiglia Ferlin umana come determinato da SMART [Schultz et
al 1998 Letunic et al 2002]
C2 (verde) è il motivo legante il calcio.
CC (giallo) è un dominio avvolto a spirale.
TM (blu) è il transmembrana (more …)
Gene
struttura. OTOF composto da 48 esoni codificanti che si
estendono oltre 100 kb di genomica DNA. I brevi isoforme hanno solo tre C2
domini. Per un riepilogo dettagliato delle gene informazioni e proteine, veditabella A, Gene.
Varianti
alleliche benigni. Sono stati descritti una serie di varianti
alleliche non patogeni. Vedi Tabella 3 (pdf).
.
Varianti alleliche patogeni Le 117 varianti sordità correlati che sono
stati riportati in OTOF sono distribuiti in tutto il gene; vedere Sordità Variazione del database [MORL
2015] e tabella 4 (pdf). La maggior parte
sono previsti per essere inattivando varianti e sono associati con grave da
sordità profonda [Yasunaga et al 1999,Adato
et al 2000, Yasunaga et al 2000, Houseman
et al 2001, Migliosi et al 2002, Mirghomizadeh
et al 2002,Rodríguez Ballesteros et al 2003, Varga
et al 2003, Hutchin et al 2005, Tekin
et al 2005, Rouillon et al 2006,Varga
et al 2006]. Nessun varianti sordità correlati sono stati
segnalati per essere più frequente in specifici gruppi etnici con l’eccezione
di c.2485C> T (p.Gln829Ter), che è presente in 3% -5% della popolazione
spagnola con grave a profonda non sindromica, sordità prelinguale [Migliosi
et al 2002, Rodríguez-Ballesteros et al 2003] (Figura 2).
Schema di OTOF sul cromosoma 2p23. La
struttura genomica OTOF comprende 48 esoni che vengono utilizzati per
trascrivere la lunga isoforma (NM_194248.1; NP_919224.1). La breve
isoforma non include i primi 19 esoni, che sono indicati come barre
blu. La proteina (more …)
Tabella
2.
Selezionata OTOF Sordità-Related allelica varianti
|
DNA Nucleotide Change |
Proteine Amino Acid Change |
Riferimenti |
Sequenze di riferimento |
|
c.1544T> C |
p.Ile515Thr |
||
|
c.2485C> T |
p.Gln829Ter |
||
|
c.2975_2976delAG |
p.Gln994ValfsTer7 |
||
|
c.4467dupC |
p.Ile1490HisfsTer19 |
||
|
c.4718T> C |
p.Ile1573Thr |
||
|
c.4819C> T |
p.Arg1607Trp |
||
|
c.5410_5412delGAG |
p.Glu1804del |
Nota sulla classificazione variante: Varianti elencate
nella tabella sono stati forniti dagli autori personale GeneReviews non
sono verificate in modo indipendente la classificazione delle varianti..
Nota sulla nomenclatura: GeneReviews segue
le convenzioni di denominazione standard del Genome Variation società umana(www .hgvs.org). Vedere di riferimento rapido per una
spiegazione di nomenclatura.
1.
Designazione Variante che non è conforme alle convenzioni
di denominazione corrente
Normal prodotto genico. Trascritti
splicing alternativo combinato con l’uso di vari differenti traduzioneiniziazione siti producono più
corti e lunghi isoforme della proteina [Yasunaga
ed altri 1999, Yasunaga
et al 2000]. I primi 19 esoni sono unici per i lunghi isoforme,
che contengono sei moduli leganti il calcio strutturali chiamati
domini C2 essenziale per vescicole-fusione della membrana, un dominio avvolto a
spirale, e un dominio transmembrana. Le lunghe isoforme di otoferlin hanno
1997 aminoacidi con sei C2 domini, un dominio avvolto a spirale e un dominio
transmembrana, e portano omologia al sinaptica proteina delle vescicole
synaptotagamin. I domini C2 legano fosfolipidi in presenza di calcio e sono
implicati in fusione delle membrane. Roux
et al [2006] ipotizzare è necessario che otoferlin per l’alto
tasso di fusione delle vescicole sinaptiche nelle cellule ciliate interne.
Anormale prodotto genico. 68 delle 117
varianti sordità legata noti sono inattivando varianti che portano proteine
significativamente anormale o, in caso di nonsense-mediata mRNA
decay, nessuna proteina affatto.Molte persone con OTOF -related
sordità ha due varianti inattivanti, suggerendo che la sordità profonda
associata a questo genotipo riflette la totale assenza di
otoferlin. Nelle persone che sono eterozigoti composti per due varianti
missenso sordità correlati, o una variante di inattivazione e una variante
missense, la variante missense è previsto per funzionare difettoso. Sia funzione difettosa (a) altera i tempi di fusione
delle vescicole sinaptiche, determinando così una perdita di codifica temporale
(dissincronia uditiva), o (b) si accumula nelle vescicole perturbano trasporto
nelle cellule ciliate interne non è noto. E ‘possibile che le
differenze funzionali possono essere associati a differenze fenotipiche
riflesse dalle differenze di acuità uditiva, anche se sono necessari ulteriori
studi per stabilire se un fenotipo esistono correlazioni
-genotype in associazione con proteine otoferlin anormale.
Nel topo, otoferlin è espresso in cocleare, vestibolare, e il
tessuto cerebrale [Yasunaga et al 1999]. Mouse cervello
e coclea hanno distinte isoforme differenti principalmente
nella inclusione di esoni 6 e 47. La conseguenza di inserimento di
quest’ultimo esone è una sequenza proteica distinta
C-terminale. Tranne per l’assenza di una breve isoforma mouse isoforma
espressione tessuto-specifica è concordante tra topo e umani[Yasunaga
et al 2000].
- Adato A, Raskin L, Petit C, Bonne-Tamir B.
Deafness heterogeneity in a Druze isolate from the Middle East: novel OTOF
and PDS mutations, low prevalence of GJB2 35delG mutation and indication
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Pubblicato online 2010 Dec 31 doi: 10.1371 / journal.pone.0015907
PMCID: PMC3013142
Caratterizzazione di nuovi Otic Enhancer della POU3F4 Gene
Reveal Signaling Pathway regolamento e Modelli distinti spazio-temporali
Àlex Robert-Moreno, 1 Silvia Naranjo, 2 Elisa de la Calle-Mustienes, 2 José Luis Gómez-Skarmeta, 2 e Berta Alsina 1, *
Bruce Riley, Editor
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Astratto
Introduzione
L’orecchio interno dei vertebrati è uno degli organi di
senso più complesse della testa e ospitare due sensi, l’udito e il senso di
equilibrio. Da uno strato ectodermica adiacente hindbrain, placode otic,
un organo sferoide è generato da invaginazione / cavitazione seguito da una
serie di processi di sviluppo come patterning, diversificazione cellulare e
morfogenesi. Nella parte ventrale dell’orecchio interno, la coclea o
organo uditivo emerge come outpocketing della vescicola otica, mentre nella
parte dorsale della vescicola otica organi vestibolari, canali semicircolari e
dotto endolinfatico sono sviluppati. In ogni organo sensoriale, l’unità
funzionale principale è composta dai capelli cellule, le cellule di supporto ei
neuroni sensoriali che collegano i capelli cellule del sistema nervoso
centrale [1], [2]. L’integrazione
dei segnali nell’orecchio interno dai tessuti circostanti è essenziale per il
corretto sviluppo. Negli ultimi anni, un gran numero di geni sono stati
divulgati a partecipare alla formazione dell’orecchio e controllo attività del
gene. Eppure, come quelli interagiscono e sono spazio-temporalmente
regolato è ancora poco conosciuta. Regioni non codificanti altamente
conservate (HCNR) sono stati rivelati e ha proposto di contenere chiave
cis-normativo elementi [3], [4]. Caratteristiche
emergenti di queste sequenze sono loro conservazione evolutiva, la loro
posizione nel genoma (a monte oa valle e anche in introni del gene che
regolano), il loro raggruppamento attorno fattori di trascrizione e loro
contributo alla malattia quando mutato [5] – [7] . Ad
oggi, sono stati identificati finora pochissime regioni regolatorie controllano
interno trascrizione genica orecchio.Recentemente, una regione regolatoria dei
geni Dlx5-Dlx6 è stato trovato dallo studio di cinque membri
affetti visualizzazione perdita di udito e difetti cranio-facciali. Gli individui
affetti condividevano una delezione di 5115 bp. Analisi bioinformatica di
questa sequenza indicava la presenza di diversi HCNR, che in un topo
transgenico saggio reporter guidato espressione nell’orecchio interno e ossa di
sviluppo [8].
Le proteine POU sono fattori di trascrizione
che si legano al DNA attraverso le loro regioni specifiche POU e
POU-omeodominio e giocano un ruolo essenziale durante lo sviluppo. Diversi
membri della famiglia POE sono espressi nell’orecchio interno. Il POU4F3 gene (Brn3c) è
specificamente indicato nella capelli cellule e provoca mutazioni POU4F3 DFNA15,
una forma autosomica dominante di perdita progressiva dell’udito [9]. Le
mutazioni in un altro membro della famiglia POU, il POU3F4 (Brn4)
provoca sordità di tipo 3 (DFN3), caratterizzata da una perdita uditiva che
deriva dalla fissazione della staffa e progressiva sordità
neurosensoriale [10]. Il POU3F4 gene
umano si trova nel cromosoma X (Xql3-Q22) essendo una delle più frequenti cause
di sordità legata all’X. Nei ratti, il gene è espresso POU3F4 durante
lo sviluppo embrionale del cervello, il tubo neurale, e la capsula otica a
E15.5 e E17.5 giorni [11]. Nei topi,
mutazioni del gene omologo causano difetti simili, come negli esseri
umani. Perdita dei tessuti derivati dal mesenchima otic
stato riferito, nonché un accorciamento della coclea suggerendo che POU3F4 potrebbe
essere richiesto per interazioni epitelio-mesenchimali che avvengono durante lo
sviluppo [12], [13]. Negli
esseri umani, oltre a mutazioni nella regione codificante, un hotspot 920 Kb 5
‘a monte del gene POU3F4 stato identificato dove diverse
microdeletions anche causato DFN3 fenotipo, suggerendo che regioni regolatorie
erano presenti in quella regione [10], [14] – [16]. Recentemente,
utilizzando genomica comparativa e saggi transgenici in diversi sistemi
modello, un esaltatore POU3F4 all’interno di un HCNR (HCNR
81.728) è stata descritta per indurre l’espressione giornalista nel mesenchima
otic. Questo laico potenziatore nelle microdelezioni piccoli dimostrato di
provocare DFN3 [17], [18]. Tuttavia,
poiché non tutte le microdelezioni influenzano questo enhancer [16], [19], è stato
ipotizzato che altri esaltatori potrebbero essere presenti nella regione
hotspot. Riportato in Naranjo et al. (2010) [18], abbiamo
identificato due esaltatori aggiuntivi in HCNR situato all’interno del 1 Mb 5
‘a monte della regione codificante Xenopus, alla posizione 970
Kb (HCNR 81675) e 170 Kb (HCNR 82.478) dell’unità codifica POU3F4 che
presentare otic attività vescicole enhancer in un test di transgenesi zebrafish. Qui,
abbiamo analizzato l’attività spazio-temporale di tali esaltatori, nonché le
vie di segnalazione che avviano la loro attività. Abbiamo trovato che le
HCNRs mostrano pattern temporali distinti di attivazione e; mentre HCNR
81675 è regolato dal acido retinoico (RA) di segnalazione, il HCNR 82.478 è
regolata dalla via Fgf e la HCNR 81.728 enhancer è sotto il controllo di
Hh. Infine vi presentiamo prova diretta che l’enhancer distale è
legato in vivo da Sox2 e fattori di trascrizione
Pax2. Nel complesso, questi dati suggeriscono che l’apparato normativo
del POU3F4è molteplice, complesso e integrare gli ingressi di
sviluppo distinti.
Materiali
e metodi
Etica Dichiarazione
Pesci transgenici Zebrafish sono stati mantenuti presso
l’impianto PRBB animali. Il nostro stabulario in conformità con le
normative nazionali ed europee è registrato come centro di ricerca animale con
il numero B9900073. Supervisione veterinaria e il benessere quotidiano di
acqua check-up vengono condotti (ossigeno disciolto, conducibilità, pH,
l’ammoniaca, nitriti, nitrati, alcalinità e durezza -Kh e GH, tra gli altri
parametri) per garantire agli animali un buono stato di
salute. Temperatura, umidità, intensità della luce e il controllo del
rumore in sala sono rigorosamente monitorized per garantire il benessere degli
animali.Embrioni di zebrafish sono stati sacrificati dopo essere stati
anestetizzati con 0,016% tricaine quando necessario. Sono state eseguite
le procedure di zebrafish sperimentali seguendo i protocolli (CEEA-PRBB ref
JMC-07-1001-CPC e MM-08-1108BAE), approvato dal Comitato Etico per la Ricerca
degli animali (CEEA) da Barcellona Parco di Ricerca Biomedica (PRBB) secondo i
regolamenti dell’Unione Europea.
Generazione di linee zebrafish transgenici
POU3F4 HCNR 81675
e HCNR linee di zebrafish 82.478 GFP sono stati ottenuti come descritto
in [18].In breve,
entrambi HCNRs sono stati selezionati sulla base di alta conservazione sequenza
del genoma umano utilizzando il browser VISTA (http://pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2). Successivamente frammenti genomici sono stati
amplificati mediante PCR da Xenopus tropicalis, clonati nel
PCR8 / GW / TOPO e linee zebrafish stabili generato dal sistema transgenesi
Tol2.
Rilevamento GFP transgenico
POU3F4 HCNR 81675
e 82478 HCNR embrioni GFP sono state organizzate in base alla morfologia e
numero della coppia somite. Per la vita di imaging GFP, embrioni
tricaine-anesthesized sono stati montati nelle diapositive con glicerolo e le
immagini sono state scattate al microscopio.
Tutto il montaggio ibridazione in situ
Tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) è stata
effettuata secondo protocolli standard [20].Brevemente,
dechorionated zebrafish embrioni sono stati fissati in paraformaldeide 4% notte
a 4 ° C e disidratato in serie metanolo, reidratato nuovo e trattati con 10 mg
/ ml proteinasi K (Sigma) per 10 minuti.Sonde digossigenina-marcate sono state
ibridate notte a 58 ° C, rilevato utilizzando pecore anticorpo
anti-digossigenina-AP a 1:2000 diluizione (Roche) e sviluppato con NBT / BCIP
(Roche). Gli embrioni sono stati utilizzati sia per l’imaging o
incorporati nel tessuto-tek ottobre (Sakura) per il sezionamento in un
criostato Leica CM1510-1 a 12 micron.
Inhibitor test trattamento
HCNR 81675 e HCNR 82.478 GFP embrioni transgenici erano
chorion forato e incubato con diversi inibitori farmacologici in acqua sistema,
da 5,5, 7,5 o 9,5 ore dopo la fecondazione (HPF) scena fino al 18-20 HPF o
36-40 HPF rispettivamente. La batteria di inibitori incluso: 30 e 50
micron SU5402 (Calbiochem) per inibire la segnalazione Fgf, 100 micron DAPT
(Calbiochem) per inibire la segnalazione Notch, 20 mM DEAB (Sigma) per bloccare
la sintesi RA, 30 micron Dorsomorphin (Biomol) per inibire Bmp segnalazione e
45 micron ciclopamina A (CyA) per inibire la segnalazione Hh. DMSO diluito
a 1/200 in acqua sistema o EtOH 95% è stato utilizzato come il trattamento di
controllo portante.
Immunostaining
Per immunocolorazione dopo DESIDERIO, POU3F4 HCNR
81675 embrioni sviluppati sono stati congelati in tessuto-tek ottobre e
sezionati (12 micron). I vetrini sono stati fissati in -20 ° C metanolo
per 10 minuti e bloccato-permeabilizzate in siero fetale bovino 10% (FBS), 3%
di albumina sierica bovina (BSA) (Sigma) in 0.1% PBT (0,1% di Tween-20) per 90
minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati colorati con coniglio
anti-GFP (Takara) a 1:400 notte a 4 ° C e asino anti-coniglio Alexa 488 (Molecular
Probes) in 1:400 per 90 minuti a temperatura ambiente, sia in 0.1% PBT, 10%
FBS, 3% BSA. Le sezioni sono state montate in Mowiol per
l’imaging. Per il doppio immunostaining, GFP transgenico è stato in grado
di essere rilevato, dopo tutte le lavorazioni, quindi HCNR POU3F4 81675
embrioni sono stati sezionati, bloccato-permeabilizzate e colorate con topo
anti-tubulina acetilato (Sigma T6793) o coniglio-PAX2 anti-(laboratori Zymed
ref.71 -6000) in 1:400 notte a 4 ° C e di capra anti-topo Alexa 546 o di capra anti-coniglio
Alexa 594 (Molecular Probes) in 1:400 per 90 minuti a temperatura
ambiente. I nuclei sono stati colorati con 4’6-diamidino-2-fenilindolo
(DAPI, Molecular Probes) per 5 minuti e montato in Mowiol.
FM® 4-64FX colorazione
Alive 3 giorni di età POU3F4 HCNR 81675
embrioni sono stati iniettati nella vescicola otica con un micromanipolatore
con il reagente FM® 4-64FX (Invitrogen) a 1:05 di diluizione in acqua, e poi a
sinistra in acqua sistema per 15 minuti, fissato a 4 % paraformaldeide (Sigma)
e congelato nel tessuto-tek ottobre (Sakura) per il sezionamento e di imaging.
Fattore di trascrizione sito di legame (TFBS) la
previsione e la mutagenesi sito-specifica
Al fine di prevedere siti TFB conservati nel POU3F4 HCNR
81675 sequenza, sequenze Xenopus umano e sono state analizzate
in rVISTA 2.0 (http://rvista.dcode.org/) che predice siti evolutivamente conservato fattori di
trascrizione vincolante. Inoltre, la sequenza di Xenopus è
stato analizzato anche TRANSFAC 7.0 nel portale regolazione genica (http://www.gene-regulation.com/index.html). PAX2 e Sox2 siti presenti nelPOU3F4 HCNR
81675 legame sono stati sottoposti a mutagenesi sito-specifica. Sulla base
del motivo e letteratura di ricerca TRANSFAC, abbiamo mutato i nucleotidi di
base dei siti Pax2 e Sox2 vincolanti progettando primer che contenevano il
legame GTGAATAG nucleo Pax2 trasformato in TCAAACAT o l’associazione ACAAAA
nucleo Sox2 mutato in GTGCTC. Primer mutante sono stati usati per
introdurre queste mutazioni puntiformi nel pCR8 / GW / TOPO TA® – HCNR 81675
costrutti con il Quik Change® XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene). Zebrafish
transgenico contenente o Pax2 o siti di legame mutanti Sox2 e il doppio mutante
per motivi PAX2 e Sox2 sono stati generati utilizzando il vettore ZED e Tol2
metodo transposon / trasposasi transgenesi [21] e gli
embrioni di F1 sono stati analizzati per la presenza di GFP dell’orecchio
interno.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) test
Vescicola otica da embrioni palco 24 e la fase 30 di
Xenopus stati sezionati e utilizzati per test cromatina
immunoprecipitazione. Analisi chip è stato eseguito con piccole modifiche
come precedentemente descritto[22]. La
cromatina è stato reticolato con formaldeide (Merck), tranciati in 200-500
coppie di basi frammenti di ultrasuoni con un sonicatore Bioruptor Diagenode
(velocità media, 8 minuti), incubate durante la notte con coniglio anti-Pax2
(laboratori Zymed) e di coniglio anti-Sox2 (Abcam , Ab15830) anticorpi e
precipitato con la proteina G / A-Sepharose (GE Healthcare). Complessi
DNA-proteina sono stati decrosslinked e cromatina immunoprecipitato è stato
utilizzato per la PCR quantitativa effettuata utilizzando kit Maestro SYBR
Green in un sistema LightCycler480 (Roche). Primer PCR per la PAX2 e Sox2
siti di legame nel Xenopus POU3F4 HCNR 81675 sono stati
progettati (Sox2TTCCAGTCTTTTCTTTTCCAAAGCT avanti, indietro TTTGCCTTTGGGCGTAATTT; Pax2CAGCATCCATTTAATTCATCAA avanti
ACA, reverse TGAAGTTTCTCTCTTCTGCAACTCTT), mentre
primer per una CNR nel Xenopus dell’emoglobina-2 locus senza
siti di legame previsti PAX2 e Sox2 secondo database rVISTA e TRANSFAC sono
stati utilizzati come controllo negativo (Xenopus scaffold_357:
988.236-988.368;TCTGCTCTCTTGTAGCTGCTGTCT avanti; retromarcia ACTTGTCCCAGGCAGCTTGT ).
Acquisizione di immagini
Le foto sono state acquisite in un microscopio DRM Leica
con una fotocamera Leica DFC300 FX e il software Leica IM50. Adobe
Photoshop CS2 è stato utilizzato per l’editing fotografia.
Risultati
POU3F4 esaltatori
dell’orecchio interno attivano l’espressione genica a diversi stadi di sviluppo
Abbiamo recentemente usato genomica comparativa e saggi
transgeniche in Xenopus e zebrafish per identificare diverse
regioni non codificanti altamente conservate (HCNR) nella regione a monte del
sito di inizio POU3F4 trascrizione con l’attività enhancer 1
Mb 5 ‘nell’orecchio interno in via di sviluppo [18] .Qui
usiamo la stessa nomenclatura utilizzata nel nostro rapporto di lavoro
precedente. Così, ogni enhancer è chiamato dalla loro posizione nel
cromosoma X umano (versione hg18) in kilobasi. HCNR 81675, 81.728 e 82.478
si trovano, rispettivamente, a 970, 922 e 70 Kb parte il POU3F4 sito
di inizio della trascrizione (Figura 1A). Per prima determinato l’insorgenza di espressione di
ciascun enhancer in linee transgeniche zebrafish stabili ospitano GFP sotto il
controllo di ciascuna di queste regioni cis-regolamentazione. In questo e
nel nostro precedente lavoro [18], abbiamo
osservato che GFP guidato dal enhancer a HCNR 81.728 divenne chiaramente
visibile a 72 HPF (dati non riportati). Dal momento che siamo
particolarmente interessati agli eventi patterning primi durante lo sviluppo
dell’orecchio interno, ci siamo concentrati negli altri due, esaltatori HCNR
81675 e HCNR 82.478, che attivano la trascrizione molto prima. A tal fine,
gli embrioni sono stati analizzati per l’espressione della GFP ogni ora dalle
10,5 ore dopo la fecondazione (HPF) a 18,5 HPF, e poi di nuovo a 24 e 36 HPF
HPF. Espressione nell’orecchio interno è stato rilevato in HCNR 81675
embrioni di 13,5 HPF (Figura 1B), mentre per HCNR 82.478 GFP otic non è stato trovato
prima del 18.5 HPF. Prima di iniziare l’espressione GFP nell’orecchio
interno, il potenziatore era attivo nei mesonefro al 17,5 HPF (Figura 1C). Il HCNR 82.478 anche droved espressione nel confine
mesencefalo-rombencefalo a 18,5 HPF e al midollo spinale a 24 HPF (Figura 1C).
Temporale pattern di
espressione di GFP guidato da POU3F4HCNR 81675 e 82478 HCRN
esaltatori.
Per verificare in quale fase, entrambe le esaltatori sono
funzionali a livello trascrizionale, tutto il montaggio ibridazione in situ
(WISH) per rilevare GFP mRNA è stata eseguita. Voglia Della stessa
embrioni stadio ha rivelato che, in entrambi i esaltatori POU3F4, GFP
mRNA trascrizione comincia due ore prima che la proteina GFP è rilevabile, a
11,5 e 16,5 HPF HPF rispettivamente (Figura 1D ed E). Così, il mRNA che a livello proteico questi risultati
indicano che entrambi esaltatori sono funzionali e regolano l’espressione del
gene reporter alla vescicola otica (tra gli altri tessuti nel caso di HCNR
82478) ma attivano l’espressione a diversi stadi di sviluppo.
Presto attivati POU3F4 esaltatori
di promuovere l’espressione a tratti sensoriali dell’orecchio interno
Dal momento che sia POU3F4 presto espresso
esaltatori di attivare l’espressione della GFP giornalista a diversi stadi di
sviluppo di zebrafish, abbiamo prossimo dosati se il modello spaziale di
espressione nell’orecchio interno anche presentato particolarità. Da 13 a
24 HPF HPF, GFP guidato da HCNR 81675 si osserva in quasi tutto il placode otic
(vedi Figura 1B). Tuttavia, a 24 HPF una vista laterale della vescicola
otica rivelato che espressione superiore è concentrata ventrale, in un dominio
ampia che comprende le zone di anteriore e posteriore otolith deposizione (Figura 2A, otoliti indicate con un asterisco). Otoliti
appaiono a 24 HPF e sono particelle di matrice gelatinosa e carbonato di calcio
che si depositano sui capelli cellule del maculae, contribuendo al senso di
gravità e accelerazione lineare. D’altra parte, l’espressione promosso da
HCNR 82478 a 24 HPF è già ristretta al dominio sensoriale, come giudicato dalla
corrispondenza anteriore e posteriore otolith (Figura 2D). Quando gli embrioni raggiungono il vecchio stadio di
3 giorni, le espressioni GFP guidato da entrambi HCNRs POU3F4 diventano
limitati a due macule sensoriale e le tre creste sensoriale associata ai canali
semicircolari (Figura 2C e F).
Spazio-temporale pattern
di espressione di esaltatori POU3F4nell’orecchio interno.
Patch sensoriali sono formate da capelli e cellule di
supporto. Così, per determinare se GFP è limitato a qualsiasi lignaggio
delle patch sensoriali otic o al contrario espressa in entrambi i tipi di
cellule, abbiamo eseguito colorazione o con un anticorpo contro la proteina
Pax2 o con mescola FM 4-64FX. In embrioni 3 giorni, la proteina Pax2 si
trova solo in capelli cellule nuclei. D’altra parte, il composto FM 4-64FX
macchie citoplasma delle cellule ciliate entrando attraverso canali ionici del
stereocilia. È interessante notare che, nel caso di HCNR 81675 enhancer,
GFP colorazione è stato osservato in cellule di supporto, ma esclusa dalla
capelli cellule marcate con Pax2 o composti FM 4-64FX (indicato in rosso
nella figura 2G e io, frecce bianche). Tuttavia, nel caso di HCNR
82478, GFP colorazione è stata osservata sia in capelli cellule e cellule di
supporto (Figura 2H e J; frecce bianche). GFP è stato trovato anche nel
ganglio otico a HCNR 82.478 (ma non per HCNR 81675) pesci transgenici, come
mostrato dalle cellule co-immunostained con anti-GFP e anti-Islet1 in
neuroblasti anteriore alla vescicola otica (Figura 2K e L).
POU3F4 distinto
esaltatori dell’orecchio interno sono sotto il controllo di diverse vie di
segnalazione
Successivo abbiamo deciso di affrontare la quale via di
segnalazione / s potrebbe controllare l’attivazione dei diversi
esaltatori POU3F4 in vivo. Embrioni transgenici
per la HCNR 81675 enhancer sono stati trattati da diversi punti temporali con
una batteria di inibitori farmacologici di vie di segnalazione
distinti. Quando gli embrioni sono stati trattati con inibitori della Fgf
(SU5402), la RA (DEAB) e Bmp (Dorsomorphin) percorsi, piccole vescicole otic
sono state osservate da tutti e tre i percorsi svolgono un ruolo essenziale
nella formazione placode otic [23] – [28]. Al
contrario, Notch (DAPT) e Hh (CyA) percorsi inibizione non ha avuto un effetto
importante sulle dimensioni della vescicola otica. È interessante notare
che l’espressione di GFP guidato da HCNR 81675 enhancer è stato perso solo
quando la segnalazione RA è stata abrogata a 5,5 HPF (Figura 3A-G e 3O), ma al più tardi stadi come 7.5 HPF o 9.5 HPF (Figura S1), che
indica che il HCNR richiede un segnale di RA presto per essere indotta. Si
noti che in queste fasi, Fgf stato inibito a bassa concentrazione di SU5402,
poiché ad una concentrazione di 50 mM formazione vescicola otica è gravemente
compromessa a causa del requisito di Fgf nell’induzione otica [26] – [29]. Ibridazione
in situ per FGF, Notch, RA, Bmp e Hedgehog geni bersaglio, come pea3, NeuroD, krox20, MSX1 e PTC1 è
stato fatto negli embrioni inibitori trattato per confermare che ogni via di
segnalazione è stata abrogata ai nostri concentrazioni di lavoro (Figura S2).
Vie di segnalazione
distinti regolano l’attivazione del POU3F4HCNR 81675 e 82478 HCNR
esaltatori.
Una procedura sperimentale simile è stata eseguita per la
HCNR 82.478 enhancer. Abbiamo trattato gli embrioni transgenici con la
stessa batteria di segnalare inibitori pathway da 5,5 HPF, 7.5 HPF (figura S3) e
9.5 palco hpf fino a 36-40 HPF (Figura 3H-N e 3P). In questo caso, gli embrioni sono state incubate fino
fasi successive quando viene rilevato segnale forte GFP nella vescicola
otica. È interessante notare che, RA segnalazione blocco non sopprimere
l’attività di HCNR 82.478 enhancer ma invece l’espressione della GFP è stato
perso dopo Fgf segnalazione inibizione in tutte le fasi testati. Questi
dati indicano che entrambi esaltatori sono regolate indipendentemente e sono
attivi sotto l’influenza di percorsi di sviluppo distinti.
Nei topi, POU3F4 lavora in modo cooperativo con il fattore
di trascrizione Tbx1 per controllare la crescita cocleare [30] e di
espressione mesenchimali di Tbx1 ha dimostrato di essere sotto
il controllo di Shh [31].Così, abbiamo
deciso di verificare se il HCNR 81.728 potenziatore era anche sotto il
controllo di questa via in linee transgeniche zebrafish. Si noti che in
zebrafish, l’espressione della GFP viene rilevata principalmente nella
vescicola otica, con un po ‘di espressione anche a mesenchima (Figura 4A e [18]).Abbiamo
trovato che, contrariamente agli altri esaltatori, il HCNR 81.728 enhancer
visualizzata una forte riduzione dell’area di espressione GFP (espressa come%
del dominio GFP) dopo il blocco di Hh percorso attraverso CyA (Figura 4A-C) suggerendo che probabilmente Tbx1 e POU3F4 condividere
gli stessi meccanismi di regolazione.
Il POU3F4 HCNR
81.728 enhancer è regolato da segnalazione Hedgehog.
GFP guidata dal POU3F4 HCNR 81675
enhancer co-localizza con pax2a e Sox2 mRNA
Per avere un quadro più chiaro sui primi eventi durante lo
sviluppo dell’orecchio interno, abbiamo poi analizzato più in dettaglio come il
primo potenziatore orecchio interno abbiamo descritto, che trova in HCNR 81675,
è controllato. In primo luogo, abbiamo confrontato il pattern di espressione
promossa da questo enhancer con quella di diversi geni espressi a livello
regionale nella vescicola otica. Abbiamo eseguito ibridazione in situ di
embrioni di 13, 15 e 18 HPF per pax2a, Sox2, SOX10 e Tbx1 e
confrontato i modelli con proteine GFP colorazione in HCNR 81675
animali transgenici. GFP è stato trovato nel dominio otico mediale anche
macchiato per pax2a (Figura 5A e D). Sox2, anche se più limitato ad una
anteriore e una regione mediale posteriore, è stato trovato anche nello stesso
dominio mediale come GFP (Figura 5B e D). Tuttavia, non vi era alcuna correlazione con gli
altri geni testati, poiché SOX10 stato espresso tutto
vescicola otica (Figura 5C) e Tbx1 è stato espresso in un
dominio laterale (dati non mostrati).Questi risultati sono stati ulteriormente
confermati da esperimenti di doppia marcatura. Doppia immunoistochimica
con un anticorpo anti-GFP e anti-Pax2a mostrato co-localizzazione di entrambe
le proteine nello stesso dominio (Figura 5E-E “), mentre anti-GFP immunocolorazione dopo ibridazione in
situ per Sox2, SOX10 e Tbx1 trascrizioni
in 15 HPF embrioni rivelato solo co-espressione di GFP e Sox2trascrizioni (Figura 5F-F “). No esatta corrispondenza con SOX10 (Figura 5G-G “è stato trovato) e dominiTbx1 di
espressione. In effetti, i domini e Tbx1 espressione GFP
si escludevano a vicenda (Figura 5H-H “).
Co-localizzazione di
Pax2 e Sox2 con GFP guidata dal HCNR 81675 enhancer.
Come già citato, abbiamo scoperto che l’attività enhancer
HCNR 81675 è regolata da acido retinoico. Così, per determinare se
l’inibizione GFP da DEAB (inibitore dell’acido retinoico) osservato negli
embrioni transgenici per la HCNR 81675 enhancer, correlata con
abrogazione pax2a e / o l’espressione del geneSox2, ibridazione
in situ per questi due geni, nonché per SOX10 e NeuroD è
stata eseguita dopo il trattamento DEAB. Infatti, RA inibizione da DEAB
guidato per una completa perdita di pax2a eespressione di
Sox2 nella vescicola otica, mentre SOX10 e l’espressione NeuroD era
simile agli embrioni di controllo trattato con DMSO (Figura 5I-P). Tutti insieme, questi risultati suggeriscono
che pax2a e Sox2espressione regolata da segnali RA
sarebbe necessaria per la corretta cis-attivazione del HCNR 81675 enhancer
nella vescicola otica.
PAX2 e Sox2 sono direttamente reclutati per la POU3F4 HCNR
81675 DNA e sono necessari per la sua funzione
Poiché pax2a e Sox2 sono
co-espressi in un dominio simile a quello promosso dalla HCNR 81675 enhancer e
inibizione dell’acido retinoico si traduce in perdita di entrambi, GFP e pax2a ed
espressioneSox2, abbiamo poi controllato per PAX2 e Sox2 siti di
legame nel HCNR 81675 sequenza genomica.Analisi TRANSFAC di 81675 sequenze
umane e Xenopus HCNR ha rivelato un elevato numero di siti di
legame conservati putativo fattore di trascrizione (TFBS). È interessante
notare che per il lavoro qui presentato, un motivo Sox putativi e due PAX2 /
5/8 motivi dove trovò nella sequenza (Figura 6A). Per verificare se le proteine PAX2 e
Sox2 sono direttamente legati a questo HCNR 81675 in vivo, abbiamo
eseguito test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Primer PCR
sono stati progettati per includere la regione di PAX2 e Sox2 siti di
legame. Vescicole Otic da stadio 30 a 34 Xenopus embrioni
sono stati sezionati e la cromatina è stata immunoprecipitati sia con coniglio
anti-Pax2 e gli anticorpi anti-Sox2 coniglio o IgG coniglio come
controllo. La figura 6B mostra che il HCNR POU3F4 81675 DNA
è stato precipitato l’anti-Pax2 e gli anticorpi anti-Sox2 ma non dai anticorpo
isotopica. Inoltre, nessun legame di queste due proteine nel
promotore dell’emoglobina Xenopus che manca Pax2 e siti di
legame di Sox2 è stato rilevato, confermando la specificità di Pax2 e Sox2
legandosi al endogena Xenopus HCNR 81675 (Figura 6B e risultati della PCR quantitativa mostrato
nella Figura 6C).
PAX2 e Sox2 sono
direttamente reclutati per la HCNR 81675 DNA.
Infine, per confermare ulteriormente che le proteine
PAX2 e Sox2 sono necessari per la funzionalità in vivodel
HCNR 81675 enhancer, abbiamo progettato primer contenenti mutazioni nei
nucleotidi di base dei siti Sox2 e PAX2 vincolanti (Figura 7A) e abbiamo eseguito mutagenesi sito-specifica di
questi siti nel HCNR 81675 sequenza. Linee transgeniche zebrafish stabili
sono stati generati con un costrutto contenente il gene GFP sotto il controllo
del potenziatore POU3F4 HCNR 81675 ospitare sia la mutazione
per la Pax2 o siti di legame di Sox2 così come doppi mutanti. Come
mostrato in Figura 7B e 7C, GFP è stata drasticamente ridotta quando entrambi i
siti di legame PAX2 e Sox2 sono mutati, ma non nel Pax2 o Sox2 mutanti singoli
(dati non mostrati), che indica che entrambe le proteine sono
direttamente legati alla POU3F4 HCNR 81675 regione di DNA e
necessarie per la sua attività enhancer.
Proteine
PAX2 e Sox2 sono necessari per HCNR 81675 attivazione enhancer.
Discussione
Ipoacusia è uno dei difetti neurosensoriale più diffusi
negli esseri umani e negli ultimi anni molte patologie dell’orecchio umani sono
stati collegati a mutazioni in oltre un centinaio di geni differenti [32], [33]. Una delle
cause più frequenti di X-linked sordità ereditaria è causata da mutazioni nel
locus POU3F4. E ‘stato descritto che le mutazioni che portano
a X-linked di tipo sordità 3 (DFN3) sindrome non riguardano solo la sequenza
codificante POU3F4 [16], ma anche
a monte non codificanti regioni, dal momento che molti pazienti umani che
mostrano ipoacusia neurosensoriale contengono microdelezioni in una regione 1
Mb 5 ‘a monte del gene POU3F4. Di conseguenza, noi ed altri
abbiamo recentemente identificato diverse POU3F4esaltatori orecchio
interno in questa regione genomica [17], [20]. In questo
lavoro, noi dimostrare che questi esaltatori hanno attività spazio-temporali
distinte e vengono attivati da diverse vie di segnalazione.
Diversi esaltatori POU3F4 auto
espressione vescicola otica
Precedente lavoro pubblicato da Ahn e colleghi ha descritto
una HCNR umano che dirige specificamente espressione POU3F4 principalmente
al mesenchima periotica in transgenici embrioni di topo lacZ [17].Con lo
screening per HCNR su una regione di 1 Mb 5 ‘a monte lla POU3F4 c oding
unità diverse altre sequenze conservate evolutivi (da uomo a Xenopus) sono
stati identificati [20]. In
zebrafish transgenico,Xenopus HCNR 81675 e HCNR 82.478 auto
specificamente espressione GFP giornalista all’epitelio otico e in fasi
successive alle patch sensoriali dell’orecchio interno. HCNR 81675 dirige
l’espressione del gene reporter solo vescicola otica, mentre HCNR 82478 agisce
come un potenziatore generale guida POU3F4 ex pressione a
tutti i tessuti in cui si esprime, come le vescicole otica, confine
mesencefalo-rombencefalo, mesonefro e del midollo spinale. Entrambi i
nuovi esaltatori otic sono ad ogni lato del POU3F4 enhancer
precedentemente identificato [17]. Così, tre
diversi esaltatori di auto espressione POU3F4 al territorio
otico indicando che POU3F4 è un fattore di trascrizione cruciale per lo
sviluppo dell’orecchio interno e che la sua espressione necessita di una
regolamentazione molto precise. Questo è ulteriormente esemplificato dalla
sua distinta attività temporale. Nei pesci transgenici stabili, GFP nella
vescicola otica si accende a diversi stadi di sviluppo, essendo il potenziatore
di HCNR 81675 attivo prima di quello a HCNR 82.478, e questo prima che
l’elemento normativo si trova nel HCNR 81728. Inoltre, l’attivazione
trascrizionale diretto da il HCNR 82.478 enhancer inizia nei mesonefro, seguita
da attività nel perimetro mesencefalo-rombencefalo e, infine, per la vescicola
otica. In seguito, a 24-32 hpf GFP non è più rilevata nelle mesonefro e in
contrasto viene attivato nel midollo spinale.
E ‘stato riportato che ben geni dello sviluppo sono molto
strettamente regolati e quindi nella loro loci diversi esaltatori sparsi sono
contenuti in giro o nel gene che regolano. Esempi si trovano nel luogo
dei Hox e IRXcluster di geni o il gene Sox2 [34], [35]. Nel caso
di Sox2, Kondoh e colleghi hanno ben sezionato fuori
l’apparato normativo genomica del locus Sox2 pollo. Undici
esaltatori sono stati identificati e da quelli, tre e due esaltatori
controllano l’espressione di Sox2 nel midollo spinale e
placode otica, rispettivamente.
Regolamentazione diversa e l’attivazione temporale di
entrambe esaltatori di epitelio otic
Lo sviluppo dell’orecchio interno è molto complessa e molte
vie di segnalazione distinti regolarlo. FGF signaling per esempio è usato
in tutto lo sviluppo orecchio per controllare i processi distinti, inizialmente
è essenziale per l’induzione del primordio otic dall’ectoderma. In
embrioni di zebrafish, perdita di FGF3 eFGF8 risultati
in completa ablazione della placode otic, mentre in pulcino e topi Fgfs dal
mesoendoderm controllare in primo luogo il processo [26] – [29], [36] – [38]. In
seguito, diversi Fgfs partecipare interno neurogenesi orecchio, la crescita e
la morfogenesi [39] – [43]. Il blocco
del Fgf segnalazione da SU5402 ha influenzato la dimensione delle vescicole
otic sia enhancer pesci transgenici per il suo ruolo nella crescita e nella
formazione placode otic. GFP guidato da HCNR 82.478 ma non da HCNR 81675 è
stato soppresso dal inibizione farmacologica della via Fgf in stadio avanzato
gastrula. L’attivazione di HCNR 82.478 da FGF signaling probabilmente
riflette un ruolo in ritardo di Fgf nello sviluppo sensoriale come molti Fgfs
sono espressi in zone sensoriali vertebrati superiori [39], [43]. Al contrario,
l’attività 81675 HCNR necessaria l’integrità del percorso RA nelle fasi
gastrula ma non nelle fasi successive. RA è sintetizzata nel mesoderma
parassiale e influenze romboencefalo e sviluppo orecchio [44] – [46]. In
zebrafish, trattamento di embrioni con bassi livelli di RA provoca l’espansione
del campo otic, suggerendo che RA ha un ruolo nel limitare il campo per
rispondere ai segnali che inducono otic [23]. Inoltre,
RA ha anche un’azione positiva per la rigenerazione e la generazione di capelli
cellule [47], [48]. RA oltre
a regolare lo sviluppo otico direttamente, nelle fasi gastrula è necessario per
una corretta patterning rombencefalo e la creazione di espressione FGF romboencefalo [23], [26]. Pertanto,
il ruolo del RA sull’attività sul 81675 HCNR potrebbe essere indiretta
attraverso l’interruzione dei segnali romboencefalo e l’effetto sinergico di
inibire RA FGF percorso a 5.5 HPF. A 9.5 HPF, entrambe le vie sono
indipendenti, in accordo con un regolazione indipendente della HCNR 82.478
enhancer da Fgf ma non RA percorso. Notch percorso ha un ruolo cruciale
nella specificazione dei domini sensoriali in diverse specie di
vertebrati [49], [50], mentre
BMP4 regola la generazione dei capelli cellule nei cerotti sensoriali [51], [52]. Per
questo motivo, era sorprendente che nessuna delle esaltatori è stata colpita da
Notch o inibizione BMP. È interessante notare che, alla fine degli anni
potenziatore a HCNR 81.728 è regolato da Hh. Questo sarebbe in accordo con
i risultati precedenti in cui è stato mostrato che la segnalazione Shh secreto
dalla notocorda e / o piastra è richiesto per la specifica della coclea [53]. Diversi
dati suggeriscono che la regolamentazione ritrovata di Hh sul HCNR 81.728
enhancer potrebbe essere mediata da Tbx1 fattore di trascrizione: primo, ci
mostrano un regolamento di Hh il potenziatore POU3F4 mesenchimali
umane; secondo, i rapporti precedenti nei topi hanno indicato che POU3F4
collabora con Tbx1 durante lo sviluppo del cocleare [30]; terzo,
espressionePOU3F4 è ridotta nei mutanti Tbx1 condizionali [54] e, infine,
Tbx1 espressione mesenchimale è regolata da Shh [31]. Così, qui
mettiamo a disposizione per la prima volta un’analisi complessiva delle vie di
segnalazione che impatto sull’espressione POU3F4, agendo
separatamente su esaltatori distinti situati in diverse HCNRs.
HCNR 81675 enhancer attività richiede Pax2 e Sox2
GFP guidato da POU3F4 HCNR 81675
co-localizzato con i domini pax2a e espressione di
Sox2 nella vescicola otica. Dal momento che i siti di legame Sox e Pax, ma
non TBX sono stati trovati nella sequenza di HCNR 81675, abbiamo ipotizzato che
sia Pax2 e Sox2 potrebbe essere attivando il potenziatore della linea transgenica
zebrafish. Ciò è stato confermato da IP cromatina e mutagenesi
sito-specifica dei siti PAX2 e Sox2 vincolanti che hanno mostrato che Pax2 e
Sox2 TF sono legati direttamente alla enhancer e regolano l’espressione della
GFP in vivo. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono
che l’espressionePOU3F4 presto diretto dal HCNR 81675 enhancer può
essere regolato mediante acido retinoico e Sox2 e fattori di trascrizione
Pax2. La nostra analisi mutagenesi del potenziatore HCNR 81675 più il
fatto che GFP si trova solo nei domini di pax2a e Sox2 co-espressione, indicano
che PAX2 e Sox2 fattori di trascrizione da soli non sono sufficienti per
attivare questo enhancer e agire in modo cooperativo sulla genomica
locus.Questo sarebbe simile a quello che è stato riportato dalla interazione
cooperativa di Pax6 e Sox2 nel-cristallina δ e esaltatori
N3 Sox2 [55].
Endogeno POU3F4 gene / POU3F4 è
espresso nel confine mesencefalo-rombencefalo, mesonefro e del midollo spinale,
così come il mesenchima periotica in Xenopus e embrioni di
topo [13] (Figura S4). Varie
possibilità potrebbe spiegare la differenza tra l’espressione POU3F4 endogena
nel mesenchima periotica e l’attivazione dei esaltatori POU3F4 nell’epitelio
otico in zebrafish. In primo luogo, le trascrizioni POU3F4endogeni
potrebbero essere presenti nell’epitelio otico a livelli più bassi e non
rilevabili mediante ibridazione in situ; in secondo luogo le differenze di
sviluppo di espressione potrebbero comparire quando esaltatori sono estratti
dal loro contesto genomico. Quest’ultima ipotesi di un regolamento
improprio esaltatori esteri è favorita dal fatto che il potenziatore umana
descritta da Ahn et al. 2009, quando inserito nel topo [17]spinge
espressione lacZ ectopica nel ganglio spirale, oltre all’espressione
mesenchimali e in zebrafish (nostro manoscritto e [20]), l’espressione
si trova principalmente nella vescicola otica. Inoltre, è stato
recentemente ipotizzato che l’espressione genica perfezionare necessario
durante l’embriogenesi sarebbe il risultato dell’interazione sinergica di
diversi elementi enhancer in maniera combinatoria [56]. A seguito
di questa nozione, le grandi regioni genomiche contenenti diversi elementi di
regolamentazione dispongano di sottorappresentazione di nucleosomi che
suggeriscono una struttura sovra-ordinata genomica [57], [58].
In conclusione, la descrizione dell’attività
spazio-temporale di nuovi esaltatori del gene POU3F4 e la loro
regolamentazione può contribuire all’ulteriore comprensione della funzione di
POU3F4 nell’orecchio interno e le sue implicazioni nella DNF3.
informazioni
di supporto
Figura S1
HCNR 81675 attività non è dipendente da RA, Fgf, Notch, Bmp
e Hh a 7,5 e 9,5 HPF. (A-N) GFP si
osserva dopo il trattamento di HCRN 81675 embrioni transgenici con inibitori
farmacologici di vie di segnalazione a 7.5 HPF (A-G ) e 9.5 HPF
(H-N). Orientamento è anteriore sinistra e dorsale fino.
(TIF)
Clicca qui per il file di dati aggiuntivi. (4.1M, tif)
Figura S2
Abrogazione di diversi geni bersaglio di segnalazione dopo
il trattamento con inibitori di segnalazione specifici. (A-J) L’ibridazione in situ per la Fgf, Notch, acido
retinoico, BMP e Sonic Hedgehog geni bersaglio pea3 (A-B), NeuroD (C-D), krox20 (E-F), msxC (G-H)
e PTC1 (I-J) per confermare l’attività inibitori alle nostre
concentrazioni di lavoro. Vista dorsale, l’orientamento è anteriore a
sinistra.
(TIF)
Clicca qui per il file di dati aggiuntivi. (4.2M, tif)
Figura S3
HCNR 82.478 attività dipende da Fgf segnalazione quando
vengono trattati a 5,5 e 7,5 HPF. (A-N)
GFP è inibita dopo il trattamento di HCRN 82478 embrioni transgenici con 30
micron SU5402 a 5.5 HPF (A-G) e 50 micron SU5402 a 7.5 HPF
(H-N). Orientamento è anteriore sinistra e dorsale in tutte le immagini.
(TIF)
Clicca qui per il file di dati aggiuntivi. (4.0M, tif)
Figura S4
Endogena pattern di espressione di POU3F4 / POU3F4 in Xenopus e
topo. (A-B) L’ibridazione in situ per POU3F4 mRNA in
embrioni di Xenopus stadio 35 (A) e lo stadio 42 (B). Si
noti che l’espressione endogena viene rilevato mesenchima periotica in fase di
42, mentre in fase di 35 POU3F4non è ancora espresso. (C-D
“) L’ibridazione in situ per POU3F4 topo mRNA in embrioni
di topi di E8.5 stadio (C) e E16.5 (D). Nei topi, anche POU3F4 è
espresso a mesenchima otic nelle fasi successive, mostrato in inserti (D ‘, D
“). Sezioni trasversali mostrate in tutti i pannelli.
(TIF)
Clicca qui per il file di dati aggiuntivi. (6.1M, tif)
Ringraziamenti
Siamo grati ad Anna Bigas e squadra Lluís Espinosa per i
protocolli Chip e commenti tecnici e Marta Linares di assistenza tecnica
criostato.
Note
Characterization
of New Otic Enhancers of the Pou3f4 Gene Reveal Distinct Signaling Pathway
Regulation and Spatio-Temporal Patterns
Àlex
Robert-Moreno, Silvia Naranjo, […], and Berta Alsina
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Caratterizzazioni clinici e
molecolari di nuovi POU3F4 mutazioni rivelano che DFN3 è
dovuta alla funzione nulla di proteine POU3F4
Hee Keun Lee, Mee
Hyun canzone, Myengmo Kang, Jung
Tae Lee, Kyoung-Ah Kong, Su-Jin Choi, Kyu
Yup Lee, Hanka Venselaar, GertVriend, Won-Sang Lee, Hong-Joon Parco, Taeg
Kyu Kwon, Jinwoong bok, Un-Kyung Kim
Genomica
fisiologici Pubblicato 1 Nov 2009 Vol.39 n.3,195-201 DOI:10,1152
/ physiolgenomics.00100.2009
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Astratto
X-linked di tipo
sordità 3 (DFN3), la forma X-linked più diffuso della sordità ereditaria, è
causata da mutazioni nel POU3F4 locus, che codifica per un
membro della famiglia POU di fattori di trascrizione. Nonostante i
numerosi rapporti su valutazioni cliniche ed analisi genetiche che descrivono
nuovePOU3F4 mutazioni, poco si sa su come tali mutazioni
influenzano le normali funzioni della proteina POU3F4 e causano malformazioni
dell’orecchio interno e la sordità. Qui si descrivono tre nuove mutazioni
del POU3F4 gene e le loro caratterizzazioni cliniche in tre
famiglie coreane che trasportano la sordità segregante al locus DFN3. Le
tre mutazioni causano una sostituzione (p.Arg329Pro) o una delezione
(p.Ser310del) di residui di aminoacidi altamente conservati nel homeodomain POE
o un troncamento che elimina entrambi i domini che legano il DNA
(p.Ala116fs). Nel tentativo di comprendere meglio i meccanismi molecolari
alla base i loro difetti dell’orecchio interno, abbiamo esaminato il
comportamento delle forme normali e mutanti della proteina POU3F4 in C3H / cellule
10T1 / 2 mesodermici. Modellazione proteina così come saggi in vitro hanno
dimostrato che queste mutazioni sono dannose per la struttura terziaria della
proteina POU3F4 e danneggiare la sua capacità di legare il DNA. Tutte e
tre le proteine mutate POU3F4 non è riuscito a transattivare
espressione di un gene reporter. Inoltre, tutti e tre non sono riusciti a
inibire l’attività trascrizionale di proteine wild-type quando
entrambi wild-type e mutante proteine erano coespressi. Poiché
la maggior parte delle mutazioni riportate per DFN3 finora sono associati con
le regioni che codificano il dominio di legame al DNA POU3F4, i nostri
risultati suggeriscono fortemente che la sordità nei pazienti DFN3 è in gran
parte dovuto alla funzione nulla di POU3F4.
SORDITÀ CONGENITA È uno dei disturbi sensoriali più comuni negli esseri
umani, che colpisce circa uno in 1.000 neonati (24). Più del 50%
della perdita dell’udito congenita è dovuta a cause genetiche, e la maggioranza
di questi casi ereditari sono nonsyndromic. Mentre la maggior parte della
perdita di udito non sindromica genetica è causata da mutazioni nei geni
autosomici, casi X-linked sono stimati a comprendere tra l’1 e il 5% di
questi(26). Finora, quattro diversi dell’udito nonsyndromic perdita loci
X-linked (DFN2, DFN3, DFN4 e DFN6) sono stati mappati, ma il gene-malattia è
stato identificato solo per il locus DFN3 (33).
X-linked di tipo sordità 3 (DFN3) rappresenta circa il 50%
di tutte le famiglie che portano la perdita di udito non sindromica legata al cromosoma
X (26).Le caratteristiche cliniche di DFN3 nei maschi affetti comprendono
anomalie temporali delle ossa, la fissazione staffa, e, nella maggior parte dei
casi, un tipo misto di perdita dell’udito, che è spesso
progressiva (7, 8, 10). Anomalie anatomiche dell’osso
temporale rivelato da computerizzata tomografia (CT) comprendono dilatazione
della estremità laterale del canale acustico interno (IAC), anormalmente ampia
comunicazione tra l’IAC e vano orecchio interno, e, a volte, ipoplasia parziale
della coclea (8, 27). Come risultato l’ampliamento del ossea
IAC, liquido cerebrospinale può entrare nel vestibolo, che è pensato per essere
alla base del fenomeno denunciato “gusher”, descritto come sgorga
fluido su di rimozione della pedana staffa durante la chirurgia
correttiva (8). Le femmine portatrici di una mutazione nel locus DFN3
tipicamente mostrano poca o nessuna perdita dell’udito(26).
Sordità segregare al locus DFN3 è associata a mutazioni
del POU3F4 gene(11). POU3F4 appartiene ad una superfamiglia
di fattori di trascrizione POU dominio, che sono caratterizzati da un DNA
bipartita dominio di legame conservato. Questo dominio è costituito da un
dominio specifico per POU e un homeodomain POU, che sono entrambi
elica-giro-elica motivi strutturali che influenzano il DNA legame e la
specificità (22). Gli studi che utilizzanoPOU3F4 ortologo
murino (BRN-4 / POU3F4) hanno dimostrato che la
proteina si lega al DNA POU3F4 sul motivo di legame POU-specifici e regola geni
bersaglio a valle (22). Espressione dei POU3F4 si
trova sostanzialmente in tubo neurale sviluppo durante l’embriogenesi, ma è
limitato al proencefalo negli adulti (20, 22). POU3F4 ha
anche dimostrato di essere espresso nel muscolo dell’arto, pancreas e orecchio
interno (12, 17,28, 29). Durante lo sviluppo dell’orecchio
interno, POU3F4 espressione viene rilevata esclusivamente nel
tessuto mesenchimale adiacente all’epitelio
otica (28, 29). Delezione mirata di POU3F4 in
topi provoca anomalie principalmente nelle strutture mesenchima derivato come
il limbus a spirale, la scala timpanica, e fibrociti striali della coclea,
nonché difetti nell’osso temporale (23, 29). Inoltre, POU3F4 topi
knockout mostrano anche malformazioni nei tessuti che normalmente non
esprimono POU3F4 quali staffa dell’orecchio medio ed i
componenti membranose della coclea, indicando possibili ruoli di POU3F4 in
interazioni reciproche tra peri-otic mesenchima e altri tessuti simili come
l’epitelio otica (29).
Numerose analisi genetiche di famiglie DFN3 hanno
identificato mutazioni nel POU3F4 gene. Questi includono
mutazioni, delezioni intragenica parziali o complete del gene, così come
delezioni, inversioni, e duplicazioni dellaPOU3F4 regione genomica
non comprende il POU3F4 sequenza
codificante(8). Caratterizzazioni cliniche di individui affetti e le loro
mutazioni specifiche nel POU3F4 sono stati
descritti (8). Tuttavia, poco si sa su come tali mutazioni
influenzano la normale funzione della proteina POU3F4, che conduce ai
caratteristici difetti dell’orecchio interno e la sordità. Né si sa come
POU3F4 contribuisce al normale sviluppo dell’orecchio interno.
Qui riportiamo tre nuova mutazioni nel POU3F4 gene
identificato in tre famiglie coreane che portano la perdita di udito ereditaria
legata al cromosoma X e la caratterizzazione clinica dei membri della famiglia
affetti.Inoltre, abbiamo effettuato modellistica molecolare e vari saggi in
vitro per comprendere le basi molecolari dei difetti dell’orecchio interno
causati da queste mutazioni.
MATERIALI E METODI
Soggetti e valutazioni cliniche.
Due famiglie coreane espongono un modello di ereditarietà
legata al cromosoma X e uno coreano famiglia in cui l’eredità X-linked era
plausibile sono state accertate presso il Dipartimento di Otorinolaringoiatria,
Yonsei University College of Medicine, Seoul, Corea del Sud. Il probando
di ogni famiglia è stato sottoposto a valutazioni cliniche dettagliate, tra cui
la storia medica, esami otologici, test audiologici, e TC dell’osso
temporale. Le valutazioni cliniche sono state eseguite anche su altri
membri delle famiglie, compresi i maschi affetti e delle femmine
portatrici. Per il test audiologica, o audiometria tronco
cerebrale-evocata risposta (BERA) o audiometria tonale (PTA) è stata effettuata
in linea con l’età del paziente, e la media tono puro è stato calcolato con le
soglie a 0,5, 1, 2, e 4 kHz. Ad alta risoluzione dell’osso temporale TC è
stata eseguita con un 16 di fila multi-detector CT scanner (SOMATOM Sensation
16; Siemens, Erlangen, Germania) utilizzando un protocollo standard osso
temporale (18). Contigue 0,7 mm scansioni dell’osso temporale sono
state acquisite sul piano assiale e coronale riformattato con incrementi di 1,0
mm. Consenso informato scritto è stato ottenuto da chi partecipa, e questo
studio è stato approvato dal Institutional Review Board della Yonsei University
College of Medicine.
Le analisi genetiche.
Per le analisi di linkage, DNA genomico da parte delle
famiglie sono stati estratti da sangue periferico utilizzando il kit di
estrazione del DNA FlexiGene (Qiagen). Essi sono stati genotipizzati con
centromerica DXS986 microsatellite marcatore (57.36 cm dal Marshfield Mappa) e
telomeric creatore DXS6803 (57,91 cm dal Marshfield Map) che fiancheggiano il
locus DFN3 (Xq21.1) con condizioni standard di PCR. La regione codificante
delPOU3F4 è stato amplificato per il sequenziamento diretto
utilizzando tre set di primer: 1) di primer forward
5′-GTAACCCGTGCTAGCGTCTT-3 ‘e invertire innesco
5′-GTCGGAGTGATCCTGGCAAT-3’, 2) forward primer
5′-CACTCACCGCACACTAACCA-3 ‘e reverse primer 5’-ACACGCACCACTTCCTTCTC-3 ‘, 3)
forward primer 5′-CTCCATCGAGGTGAGTGTCA-3′ e 5′-innesco inverso
GGAGCCAGGAATATGAGATCC-3 ‘. I frammenti di DNA amplificati sono stati
sequenziati con un ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (V3.1) e
un analizzatore ABI PRISM 3130XL DNA (Applied Biosystems). I dati sono
stati analizzati utilizzando ABI Sequencing Analysis (v.5.0) e software
Lasergene-SeqMan. Le sequenze risultanti sono stati confrontati con
il POU3F4 sequenza dal GenBank (senza adesione. NM_000307).Abbiamo
anche sequenziato 70 coreani con udito normale per determinare se le mutazioni
sono state presentate nel inalterato popolazione coreana.
Modellistica molecolare.
La struttura cristallina di POU2F1 / Ott-1 è stato
utilizzato come modello per costruire un modello di wild-type e le proteine
mutanti POU3F4.Modellazione è stata effettuata con il software
SE (34) con le
impostazioni di parametri standard e protocolli come descritto in
precedenza (4, 9). I dettagli del protocollo di modellazione,
inclusi i file utilizzati, l’allineamento di sequenze, scelte di parametri,
ecc, sono disponibili dahttp://www.cmbi.ru.nl/~hvensela/pou3f4/.
Costruzione di plasmidi.
Per costruire vettori di espressione per wild-type e le
proteine POU3F4 mutanti, il full-length open reading frame (ORF)
del singolo-esone POU3F4gene è stato amplificato mediante PCR dal
DNA genomico di normale o colpiti maschi e sub-clonato nel pcDNA3 vettore di
espressione. Le coppie di primer utilizzati erano
5′-atgaattcatggccacagctgcctcg-3 ‘e
5′-atgcggccgctcagagatcatggcaag-3′. Oligonucleotidi codificanti
l’emoagglutinina (HA) sono stati inseriti epitopo al 5 ‘del POU3F4 ORF.
Immunocitochimica.
C3H10T1 / 2 cellule coltivate su un vetrino da camera
LabTek 8 sono state trasfettate con wild-type o mutanti plasmidi di espressione
POU3F4, insieme con EGFP plasmide. Quarantotto ore dopo, le cellule sono
state fissate con paraformaldeide al 4% per 10 min e permeabilizzate dello 0,5%
Triton per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule sono state poi
incubate sequenzialmente con anticorpo monoclonale anti-HA (Zymed) notte a 4 °
C, 568 AlexaFluor anti-topo IgG (Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente,
e 4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindole per 5 min a temperatura ambiente.Immagini
delle cellule immunostained sono state scattate con microscopio a fluorescenza
Olympus IX70 dotato di fotocamera Olympus DP70 (Zeiss) e trattati con Adobe
Photoshop (Adobe Systems). Per determinare le percentuali delle cellule
che esprimono proteine POU3F4 fuori del nucleo, 100-200 cellule
di ogni camera sono state contate manualmente da un ricercatore cieco alle
identità campione. Grafici sono state tracciate in base ai numeri raccolti
da almeno tre esperimenti indipendenti.
Espressione e purificazione della proteina ricombinante
POU3F4.
A glutatione S-transferasi (GST) POU3F4 plasmide
ricombinante è stato costruito dal subcloning frammento digerito contenente
intere sequenze POU3F4 in pGEX-4T-1 Kpn I / Eco sito
RI. Proteine di fusione GST sono stati purificati da
rispettivi Escherichia coli estratti BL21 con
glutatione-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) secondo le procedure
standard(14).
Elettroforetica mobility shift assay.
Le sequenze di oligonucleotidi a doppio filamento
utilizzati per rilevare le attività che legano il DNA di POU3F4 sono stati i
seguenti: 5′-CAATATGCTAATCAATATGCTAAT-3 ‘. La miscela di reazione per
elettroforetica mobility shift assay (EMSA) conteneva 20 mM Tris · HCl, pH 7,6,
1 mM ditiotreitolo, 2 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 1% NP-40, 1 mg
poli (di- dC), e le proteine di fusione purificate 2 mg
GST-POU3F4 ricombinanti. Oligonucleotidi non marcati sono stati aggiunti
nella miscela di reazione e incubate per 10 min a temperatura
ambiente. [32 P] è stato aggiunto -labeled DNA sonda (300.000 cpm), e
la reazione di legame è stato permesso di proseguire per altri 20
min. Miscele sono stati risolti su gel di poliacrilammide 8% a 150 V per 4
h.Gel sono stati essiccati e sottoposti ad autoradiografia.
Saggi di Trascrizione giornalista.
I plasmidi reporter luciferasi sono stati costruiti
inserendo sia la regione a monte promotore umano POU3F4 gene
(-482 a +25), o due o tre copie del elemento di associazione POU3F4
(CAATATGCTAAT) nel vettore base pGL2 (21). C3H10T1 / 2 cellule
piastrate in piastre da 24 pozzetti sono state cotrasfettate con 300 ng di
wild-type o mutanti espressione POU3F4 plasmide, o entrambi plasmidi insieme,
150 ng del reporter luciferasi plasmide, e 20 ng di SV40-renilla plasmide per
la trasfezione controllo dell’efficienza. Le cellule transfettate sono
state incubate per 24 ore e sottoposte al saggio di luciferasi secondo il
protocollo del produttore (Promega). Efficienza di trasfezione in ogni
condizione sono stati normalizzati con attività renilla luciferasi, che era
sotto il controllo di un promotore SV-40. I risultati sono stati tracciati
basata su almeno tre esperimenti indipendenti.
RISULTATI
Caratterizzazioni cliniche di famiglie portatrici sordità
legata all’X.
Il pedigree di SV08-18 famiglia ha mostrato un tipico
pattern di ereditarietà recessiva X-linked di perdita dell’udito (Fig. 1 A). Misurazioni PTA indicato che i probandi di questa
famiglia (IV-2, 6 anni) aveva un tipo misto grave di perdita (dell’udito Fig. 1 B). Altri
tre anziani maschi affetti (III-3, 36 anni; III-6, 29 anni; III-7, 16 anni)
hanno mostrato modelli simili di perdita dell’udito, ma le soglie erano
superiori a quella del probando (Fig. 1 B ). Sebbene i dati longitudinali sulla perdita
dell’udito non erano disponibili per questi membri maschi della famiglia,
perdita di udito più grave mostrato in maschi più anziani soprattutto nella
componente neurosensoriale suggerito progressività di ipoacusia, come riportato
in precedenza (8). Due femmine portatrici nella famiglia (III-2,
III-4) avevano udito normale (Fig. 1 B).
Fico. 1.
Caratterizzazioni cliniche della SV08-18
famiglia mostrando la perdita di udito ereditaria legata all’X. A:
pedigree che mostra un tipico modello di ereditarietà recessiva X-linked di
perdita dell’udito. Square (di sesso maschile), cerchio (femmina),
ombreggiato (individuo affetto), ridotto (deceduto), cerchio con un punto
(mutazione portatore femmina), freccia (i probandi della famiglia). B:
audiogrammi del probando (IV-2 , sono mostrati 6 anni), con una grave perdita
di udito mista e membri più anziani di sesso maschile con peggio udito.Un
vettore femminile (III-4, 32 anni) mostra un udito normale. ○ (a destra)
× (a sinistra): soglia di conduzione dell’aria. <(A destra)> (a sinistra):
soglia di conduzione ossea. . dBHL, decibel udito livello C:
alta risoluzione computer-assistita tomografia (CT) scansioni delle ossa
temporali del probando (IV-2) mostra reperti caratteristici di X-linked di tipo
sordità 3 (DFN3) come collegamento fistolosa tra il basale turno di coclea e
condotto uditivo interno e difettoso modiolus cocleare (a sinistra del
pannello, punta di freccia), a differenza del normale aspetto di modiolus
cocleare nel normale dell’osso temporale (a destra del
pannello, freccia).
La seconda famiglia, SV08-17, ha anche mostrato un tipico
pattern di ereditarietà recessiva X-linked di perdita dell’udito. Cinque maschi
essere colpiti in tre generazioni (.. Suppl Fig S1) 1 Il probando è
stata diagnosticata grave perdita di udito da BERA [soglie > 60 dB NHL
(decibel livello udito normale)] 1 mese dopo la nascita ed è in processo di
riabilitazione uditivo con gli apparecchi acustici. Un altro maschio
affetto nella famiglia (II-4, 23 anni) è stato anche diagnosticato con perdita
di udito all’età di 6 anni e ha sviluppato la comunicazione verbale limitato
solo con gli apparecchi acustici.
Nella terza famiglia, SV08-21, i probandi è stata
diagnosticata con grave perdita di udito da BERA (75 e 90 dB NHL sul lato
destro e sinistro, rispettivamente) all’età di 2 anni (Suppl. Fig.
S1). Test Audiologic non era disponibile per gli altri membri della
famiglia, anche se il prozio del probando aveva sospettato la perdita
dell’udito. Poiché il probando e sua madre portava la stessa mutazione, la
perdita di udito sembrava essere ereditata in un modello recessivo X-linked in
questa famiglia (Fig. 2, dati non mostrati).
Fico. 2.
Tre nuove mutazioni in POU3F4 locus
sono tenuti a influenzare l’interazione proteina-DNA di POU3F4 proteine. A-C: nuove
mutazioni identificate in 3 famiglie coreane portando X-linked sordità
ereditaria. A: SV08-18 famiglia presenta una mutazione di G a C a
nucleotide posizione 986, che si traduce in una conversione di arginina a
prolina nella posizione amminoacidica 329 (p.R329P). Questa modifica
G-to-C si osserva in tutti i maschi affetti, ed è stato rilevato G / C
eterozigosi in tutte le femmine portatrici. B: una delezione
di 1 bp identificato nella SV08-17 famiglia provoca uno spostamento telaio di
26 aminoacidi a partire da alanina a la posizione aminoacidica 116, seguito da
un troncamento (p.Ala116fs). C: una delezione di nucleotidi 3
dalla posizione 927 al 929 rilevato in SV08-21 famiglia provoca una delezione
aminoacido singolo (p.S310del) senza influenzare il telaio codifica . D:
mostra schematicamente POU3F4 proteina marcata con le 3 nuove mutazioni
identificate in questo studio. POU-specifici e homeodomain sono
mostrati come scatole, rispettivamente rosso e blu, e 3 segnali putativi di
localizzazione nucleare (NLS) sono indicati come scatole gialle sopra la
omeodominio POU-specifico o POU. Le posizioni della mutazione sono
indicati con le frecce, e la posizione di cessazione anticipata in mutazione
p.Ala116fs è contrassegnato da un asterisco. p.R329P mutazione si trova in
una delle putative NLS nella POE omeodominio. E: allineamento della
sequenza di amminoacidi del 2 ° e 3 alfa-eliche nelle proteine
POU3F4 da diversi eucarioti. Sequenza aminoacidica in
questa regione è altamente conservata nei mammiferi. F-H:. Modellistica
molecolare del wild-type e le proteine mutanti POU3F4 F:
il 3 ° elica nel homeodomain POU illustrato. Il residuo amminoacido
verde è Arg329. DNA è mostrato in una rappresentazione ball-and-stick
giallo. G: p.R329P mutazione si trova nella terza α-elica della
homeodomain POE dovrebbe destabilizzare la struttura elicoidale, che
interessano le interazioni proteina-DNA appropriate. Le 2 glutammati
che avevano una interazione con arginina persi sono mostrati, come è il
asparagina che rende importanti,-specificità relativi contatti DNA. H:
nel mutante p.S310del, la mancanza di un residuo amminoacidico causerà uno
spostamento di uno posizione per tutti i residui successivi, interrompendo
normali interazioni. I dettagli della modellazione sono disponibili
anchehttp://www.cmbi.ru.nl/~hvensela/pou3f4/.
Ulteriori TAC eseguite su sei pazienti da tutte le tre
famiglie hanno rivelato che i difetti delle ossa temporali erano comparabili
per tutti i pazienti esaminati e sono stati quelli tipici di
DFN3 (8, 27), tra cui un ampio collegamento fistoloso tra il giro
basale della coclea e IAC e difetti nella modiolus cocleare (Fig. 1 C; dati non mostrati). Nessun altro deficit medici o neurologici sono stati
identificati in nessuno dei membri della famiglia affetti.
Linkage e mutazione analisi.
Dal momento che le storie di famiglia e valutazioni cliniche
di tutti e tre famiglie erano caratteristici per DFN3, abbiamo effettuato
analisi di linkage con DXS986 e DXS6803 marcatori microsatelliti. Sordità
mostrato linkage al locus DFN3 in queste famiglie (Suppl. Fig. S1), quindi
abbiamo cercato mutazioni nel POU3F4 gene nei membri affetti
delle famiglie dal direttamente sequenziamento del POU3F4 regione
codificante. Sequenza analizza in SV08-18 famiglia rivelato una mutazione
puntiforme al nucleotide 986, guanina citosina (c.986 G> C) (Fig. 2 A). Questo cambiamento nucleotide converte un arginina
ad una prolina in posizione 329 aminoacidi (p.R329P), che è una delle più
residui conservati nella omeodominio POU della proteina POU3F4 (Fig. 2 E).
Sequenza di analisi SV08-17 famiglia identificata una
coppia sola base (bp) delezione a nucleotide posizione 346 (c.346delG) (Fig. 2 B). Questa mutazione provoca uno spostamento telaio
che codifica 25 nuovi aminoacidi seguiti da premature terminazione della
proteina nella posizione aminoacidi 141 (p.Ala116fs). Ciò si traduce in
una forma troncata della proteina POU3F4 manca entrambi i domini di legame di
DNA (Fig. 2 D).
I membri affetti di SV08-21 famiglia avevano una delezione
in-frame di tre nucleotidi (c.927-929delCTC; Fig. 2 C), con conseguente eliminazione della serina amminoacido
(p.S310del) nella omeodominio POU (Fig . 2C).
Analisi strutturali del wild-type e le proteine
mutanti POU3F4.
La proteina POU3F4 costituito da un NH 2 dominio
-Terminal importante per l’attività trascrizionale e due domini che legano il
DNA COOH-terminali.Questi domini DNA-legame consistono dominio specifico POU
collegate da una regione linker breve al omeodominio POU (13, 20, 22) (Fig. 2 D). Tutte e tre le
mutazioni identificate in questo studio sono stati tenuti a influenzare il DNA
legame attività della proteina POU3F4, perché colpiscono uno di questi
domini. Per esaminare l’effetto delle mutazioni sulla struttura terziaria
della proteina POU3F4, modelli molecolari di tipo selvaggio, p.R329P e proteine
POU3F4 p.S310del stati costruiti basati sul noto struttura
cristallina della proteina POU2F1 / Oct-1 ( 19).
La mutazione p.R329P si trova nel terzo α-elica della
homeodomain POE, che è cruciale per interazioni proteina-DNA (Fig. 2, E-G). La
sostituzione di prolina per arginina normale in questa posizione dovrebbe
essere dannoso per la struttura α-elica dovuta alla destabilizzazione di
due importanti sale ponti così come la perdita di una serie di contatti
idrofobici. Inoltre, la struttura di aminoacido catena laterale di prolina
inserisce tipicamente una curva obbligato che interrompe strutture alfa-elicoidale. Tali
disturbi in genere tendono a ridurre massicciamente le interazioni proteina-DNA
corretta.
Il residuo serina alla posizione 310 si trova al centro del
secondo α-elica della homeodomain POE (Fig. 2 E). Questa elica non è in contatto diretto con il DNA,
ma è probabile importante per la struttura complessiva del homeodomain
POE. Il modello di omologia suggerisce che la struttura α-elica
rimane dopo l’eliminazione del residuo di serina (p.S310del) (Fig. 2 H).Tuttavia, poiché l’assenza di un residuo causerà uno
spostamento di una posizione per i successivi residui in questa elica, ciò avrà
effetti drammatici sulla stabilità di questa elica perché diverse interazioni
idrofobiche andranno persi e un residuo polare diventerà sepolto nel core
idrofobico della proteina. Di conseguenza, l’interazione con gli altri
eliche è disturbato e la stabilità complessiva del dominio è diminuita, che
ridurre fortemente la sua capacità di legame del DNA.
Effetti delle mutazioni POU3F4 sul DNA attività di
legame.
Il nostro studio di modellazione ha suggerito che tutte e
tre le mutazioni identificate nei pazienti DFN3 sono probabilmente interessando
DNA capacità di legame alterando la struttura terziaria del DNA domini di
legame della proteina POU3F4. Per verificare questa possibilità, abbiamo
condotto EMSA. Vettori di espressione codificanti wild-type e forme mutanti
di proteine POU3F4 sono stati costruiti, e le proteine
sono state tradotte in vitro. Le capacità DNA-binding della
in vitro tradotti e proteine purificate POU3F4 sono stati testati
con la sonda oligonucleotide (CAATATGCTAAT) che ha dimostrato di legarsi in modo
specifico le proteine POU3F4 murine(21). Come mostrato
in Fig. 3 A, wild-type proteine POU3F4 legate fortemente
agli oligonucleotidi marcati per formare complessi proteina-DNA (Fig. 3 A, freccia). Specificità dell’interazione proteina-DNA è stata
confermata da esperimenti di competizione, in cui l’aggiunta di sonde
oligonucleotidiche senza etichetta abolito completamente le interazioni
proteina-DNA. In contrasto con il wild-type POU3F4, non rilevabili
complessi proteina-DNA sono stati osservati con una qualsiasi delle forme mutanti
di POU3F4. Questi risultati indicano che le mutazioni seriamente
compromettere la capacità delle proteine POU3F4 di legare
sequenze di DNA bersaglio.
Fico. 3.
Capacità di legame al DNA e
localizzazione subcellulare sono stati interrotti dalle mutazioni POU3F4. A:
elettroforetico mobility shift assay (EMSA). Proteine
POU3F4 wild-type formato un complesso proteina-DNA con gli
oligonucleotidi marcati (corsia 3, freccia), che sono stati
completamente interrotti con l’aggiunta di oligonucleotidi senza etichetta come
concorrenti (corsie 7, 8). Al contrario, p.R329P (corsia 4),
p.S310del (corsia 5), o p.A116fs (corsia 6) proteine
mutanti non è riuscito a legarsi alle molecole di DNA. B:
Analisi immunocitochimica con anticorpi anti-emoagglutinina (HA) di anticorpi
wild-type e le proteine mutanti POU3F4 transitoriamente espressi
in C3H10T1 / 2 cellule. Mentre le proteine POU3F4
wild-type sono stati per lo più localizzati all’interno del nucleo, la maggior
parte delle proteine POU3F4 mutanti sono stati trovati nel nucleo
e nel citoplasma. C: grafico quantificare la percentuale di cellule che
esprimono proteine POU3F4 fuori del nucleo.
Effetti delle mutazioni POU3F4 sulla localizzazione
subcellulare.
Il programma per elaboratore “predictNLS” (5) prevede
tre putativi segnale di localizzazione nucleare (NLS) motivi in wild-type
POU3F4. Uno di questi si trova nel dominio specifico POU e gli altri due
sono in homeodomain POE(Fig. 2 D). La mutazione p.R329P si trova in uno dei motivi
NLS nel omeodominio POU, e la mutazione p.S310del si trova tra i due NLS nel
homeodomain POU (Fig. 2 D). I troncante mutazione (p.Ala116fs) si traduce in
una proteina che non ha nessuno dei motivi NLS a causa della mancanza dei
domini di legame del DNA.
Per determinare come queste mutazioni influenzano la
localizzazione nucleare delle proteine POU3F4, vettori di
espressione codificanti wild-type o proteine mutanti POU3F4 fusa
con l’epitopo HA sono state transitoriamente espresse nelle C3H10T1 / 2
celle (30). Abbiamo scelto questa linea cellulare mesenchimali del
mouse da POU3F4 si esprime principalmente nel mesenchima
circostante l’orecchio interno in via di
sviluppo (28). Immunofluorescenza analisi utilizzando anticorpi
anti-HA o anti-POU3F4 hanno dimostrato che le proteine POU3F4 wild-type
sono stati localizzati esclusivamente nei nuclei delle cellule
trasfettate (Fig 3. B, dati non riportati). Al contrario, la maggior parte dei p.R329P o p.Ala116fs
POU3F4 proteine, in cui almeno un motivo NLS viene perturbato, sono stati
trovati sia nel citoplasma e il nucleo (Fig. 3 B). Anche se ci
aspettavamo localizzazione nucleare normale per il mutante p.S310del, che ha
conservato tutti e tre i motivi NLS putativi, proteine POU3F4 con
questa mutazione anche perso il loro normale localizzazione subcellulare e sono
stati trovati in tutte le cellule. Questo mislocalization potrebbe essere
dovuto ai cambiamenti nella struttura terziaria della homeodomain POE in cui i
domini NLS risiedono.
Effetti delle mutazioni POU3F4 sulle attività
trascrizionale.
L’incapacità delle proteine mutanti POU3F4 di
legarsi alla sequenza del DNA di destinazione o di localizzare correttamente
nel nucleo fortemente suggerito che l’attività trascrizionale delle proteine
mutanti POU3F4 inoltre sarebbe gravemente compromessa. Per
verificare ciò, abbiamo costruito un plasmide reporter in cui l’espressione del
gene luciferasi di lucciola è regolata dal promotore (da -472 a +25 bp) del
umana POU3F4 gene, che ha dimostrato di essere regolata
direttamente dal POU3F4 proteina stessa(21). Il plasmide reporter è stato
cotransfected con il plasmide codificante wild-type o mutanti POU3F4 in C3H10T1
/ 2 celle, e la capacità di ciascuna proteina di transattivare POU3F4 il gene
reporter è stato valutato misurando l’attività della luciferasi in cellule trasfettate. In
questo sistema, proteina wild-type POU3F4 attiva l’espressione del gene
reporter quasi triplicato, ma tutte e tre le proteine POU3F4
mutanti omesso di attivare l’espressione genica(Fig. 4 B), indicando che i POU3F4 mutazioni abolire completamente l’attività trascrizionale
di proteine POU3F4. Effetti simili sono stati osservati con
un altro costrutto reporter di luciferasi cui espressione è sotto il controllo
di due o tre copie dell’elemento riconoscimento POU3F4 (CAATATGCTAAT)(21) (dati non mostrati). Avanti, abbiamo testato per vedere se le proteine
POU3F4 mutanti potrebbero agire varianti come
dominanti-interferenza.Quando entrambi wild-type e una qualsiasi delle proteine
POU3F4 mutanti sono stati coexpressed, l’espressione giornalista
attivato da wild-type proteina POU3F4 non è stata influenzata, indicando che le
proteine POU3F4 mutanti non ha inibito l’attività trascrizionale
normale di proteine wild-type (Fig. 4 B). Questi risultati
dimostrano che le tre mutazioni identificate nei pazienti DFN3 causano nulli funzionali
della proteina POU3F4.
Fico. 4.
Attività trascrizionale di POU3F4 è stato
abolito dal POU3F4 mutazioni. A: attività luciferasi
in cellule cotransfected con varie proteine POU3F4 e il reporter
costrutto promotore-assente. Nessuna attività luciferasi è stata
osservata in cellule che esprimono entrambi wild-type o proteine
POU3F4 mutanti. B: attività luciferasi nelle cellule
cotransfected con il costrutto giornalista che contiene la regione del
promotore POU3F4 (da -472 a +25 bp) e varie forme di proteine
POU3F4. Wild-type proteina POU3F4 upregulated
l’espressione del gene reporter, mentre nessuna delle proteine
mutanti POU3F4 fatto. Cotrasfezione del wild-type e dei
mutanti qualsiasi indotti attività luciferasi paragonabili al livello attivato
dalla sola wild type. * Significativamente diverso da wild type
(t-test, p <0,001); #non significativamente diversi da
wild type (P> 0,1).
DISCUSSIONE
Abbiamo identificato tre nuova mutazioni nel POU3F4 gene
in tre famiglie coreane visualizzazione collegata a X ereditarietà di perdita
dell’udito. Due delle mutazioni (p.R329P e p.S310del) si verificano nel
omeodominio POU, e la terza mutazione (p.Ala116fs) provoca una terminazione
prematura, causando una proteina priva gli interi domini che legano il
DNA (Fig. 2).Come i tre mutazioni
che abbiamo studiato qui, la maggior parte deiPOU3F4 mutazioni
identificate nei pazienti DFN3 specificano cambiamenti di aminoacidi in regioni
che codificano i domini che legano il DNA, in maggioranza nel homeodomain
POE (8), suggerendo
che la perdita del DNA capacità di legame può essere un meccanismo patologico
comune a livello molecolare. Infatti, la modellazione di proteine
e diverse analisi molecolari dimostrano che i POU3F4 mutazioni
gravemente perturbare la capacità di legame al DNA di POU3F4, quindi abolire
completamente l’attività trascrizionale della proteina (Figg. 3 e 4). Le proteine POU3F4
mutanti non sono riusciti a inibire l’attività normale trascrizionale di
wild-type POU3F4, escludendo la possibilità che le proteine
mutanti agiscono varianti come dominanti-interferenza. La sovraespressione
delle proteine mutanti in C3H10T1 POU3F4 / 2 cellule non sembrano
avere effetti deleteri evidenti sui comportamenti cellulari normali come la
proliferazione cellulare o morte cellulare (dati non riportati). Insieme,
queste osservazioni suggeriscono che la perdita dell’udito in DFN3 è causata
dalla perdita di funzione della proteina POU3F4 anziché dal guadagno di
funzioni ectopici di proteine mutanti. Valutazioni cliniche
di pazienti DFN3 in questo studio sono in linea con i rapporti già pubblicati
che hanno dimostrato una chiara correlazione genotipo-fenotipo tra i diversi
tipi di POU3F4 mutazioni e l’orecchio interno(26).
Mutazioni in POU4F3, un altro fattore di
trascrizione POU dominio, sono stati implicati in autosomica dominante sordità
DFNA15 (32). Simili nostri risultati POU3F4, analisi
molecolari POU4F3 mutazioni identificate in pazienti DFNA15
dimostrato che le proteine mutanti POU4F3 mancano attività
trascrizionale a causa della perdita di localizzazione nucleare e la capacità
di legame al DNA (6, 35). Pertanto, i due fattori di
trascrizione POU famiglia condividono un meccanismo patologico molecolare
comune, per cui la trascrizione di geni essenziali per lo sviluppo
dell’orecchio interno bersaglio è interessato. Coerentemente con la sua
espressione nelle cellule dei capelli, POU4F3 ha dimostrato di regolare i geni
importanti per la differenziazione delle cellule dei capelli come Gfi1 e LHX3 (15, 16). Allo
stesso modo, la perdita di udito in DFN3 da POU3F4 mutazioni è
probabilmente associata con la mancanza di espressione del gene bersaglio a
valle (s), che svolge un ruolo critico nello sviluppo dell’orecchio interno,
soprattutto nel rimodellamento mesenchimali e le interazioni
epiteliali-mesenchimali otic. Solo pochi geni bersaglio di POU3F4 sono
stati identificati in altri tessuti: gene proglucagon nelle alfa-cellule del
pancreas(17), D1A
dopamine recettore gene nello striato (25), e
umano involucrin gene nell’epidermide (36 ). Tuttavia,
poco si sa su bersagli a valle di POU3F4 nel mesenchima peri-otic dove POU3F4 si
esprime attivamente(28). I temporali TC osseo dei pazienti DFN3 nonché
la POU3F4eliminazione diretta fenotipi dell’orecchio interno
suggeriscono che la maggior parte delle malformazioni dell’orecchio interno
sono stati trovati nelle strutture derivanti dal
mesenchima (23, 28). Pertanto, chiarire gli obiettivi a valle di
POU3F4 nel mesenchima peri-otic sarà cruciale per capire come POU3F4
normalmente contribuisce alla patterning mesenchimali nello sviluppo
dell’orecchio interno.
Mentre i geni regolati da POU3F4 non sono chiare, studi
precedenti forniti suggerimenti su come il POU3F4 gene è
regolato nel mesenchima peri-otic durante lo sviluppo dell’orecchio
interno. TBX1, un membro della famiglia genica T-box di fattori di trascrizione
e conosciuto gene-malattia per la sindrome di DiGeorge, si esprime sia nella
epitelio otic e mesenchima peri-otic (1). Gli studi che
utilizzano topi knockout tessuto-specifici suggeriscono che Tbx1 espresso
nel mesenchima è necessaria per l’espressione mesenchimale di POU3F4 (1), anche
se non è chiaro se Tbx1 regola direttamente la mesenchimale POU3F4 espressione. Coerentemente
con questo, una interazione genetica tra Tbx1 e POU3F4 ha
dimostrato di essere necessari per la formazione cocleare normale (3). È
interessante notare che le espressioni di entrambi Tbx1 e POU3F4 nel
mesenchima dipendono Sonic hedgehog (31). Così, una via molecolare
di Shh-Tbx1-POU3F4 è stato proposto nel mesenchima peri-otic
di essere coinvolti nel normale patterning cocleare (2). Ulteriori
analisi delle reti molecolari che regolano POU3F4 nonché geni
a valle regolati da POU3F4 sono garantiti per produrre una
migliore comprensione dei ruoli di POU3F4 in normale patterning orecchio
interno, così come il meccanismo causale della DFN3.
BORSE
Questo lavoro è supportato dalla Corea
Sanità Technology R & S del progetto, Ministero della Salute, del Benessere
e della famiglia, Repubblica di Corea, Grant A080588 (J. Bok, U.-K. Kim), per
un assegno di ricerca di assicurazione sulla vita Filantropia Fondazione, dal
Ministero della Pubblica Istruzione coreana attraverso la Corea 21 Brain
Project (HK Lee, S.-J. Choi), e dal Centro di Bioinformatica Olanda (H.
Venselaar).
RINGRAZIAMENTI
Ringraziamo Drs. Dennis T. Drayna e Doris K. Wu per la
lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche Jin Ahn per
l’assistenza tecnica.
Note
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↵ 1 La versione online di questo articolo contiene
materiale supplementare.
·
Copyright © 2009 American Physiological
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